[發明專利]一種利用人體廢棄胚胎建立人胚胎干細胞系的方法

無效

• 申請號: 201210221563.4
• 申請日: 2012-06-30
• 公開（公告）號: CN102703381A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 孫瑩璞;王芳;孔慧娟;李婧;戴善軍;辛志敏;金海霞;宋文妍;姚桂東
• 申請（專利權）人: 鄭州大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙) 41113
• 代理人: 聶孟民

1.一種利用人廢棄胚胎建立人胚胎干細胞系的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）收集并培養廢棄胚胎：收集新鮮的廢棄胚胎或對冷凍的胚胎進行解凍，按照常規方法進行培養；

（2）飼養層細胞的制備：按照常規方法分別制備小鼠胚胎成纖維細胞和小兒包皮成纖維細胞；

（3）混合飼養層的制備：分別收集步驟（2）中制備的小鼠胚胎成纖維細胞和小兒包皮成纖維細胞，分別經磷酸緩沖液漂洗，絲裂霉素C處理后，得到小鼠胚胎成纖維細胞或小兒包皮成纖維細胞的細胞懸液；按照細胞個數1：1的比例混合小鼠胚胎成纖維細胞或小兒包皮成纖維細胞，得混合細胞懸液，按照0.55~0.65×10⁵個/cm²的密度，將上述混合細胞懸液均勻鋪在明膠包被的培養皿中；培養皿放入35~38℃、體積濃度為4~6％的CO₂培養箱中，培養12~14h即得混合飼養層；?

（4）人胚胎干細胞系的建立：采用常規的機械法分離步驟（1）所得的廢棄胚胎的內細胞團，將分離的內細胞團置于步驟（3）所得的混合飼養層上培養，建立人胚胎干細胞系。

2.?根據權利要求1所述的利用人廢棄胚胎建立人胚胎干細胞系的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）收集并培養廢棄胚胎：收集新鮮的廢棄胚胎或對冷凍的胚胎進行解凍

收集新鮮的廢棄胚胎，其方法為：將2-3天的不適合移植和冷凍的廢棄胚胎，移入胚胎培養液微滴中，置于35~38℃、體積濃度為4~6％的CO₂培養箱中培養至第5～7天，每日觀察更換培養液；

對冷凍的胚胎進行解凍：從液氮中取出裝有胚胎的麥管，室溫氣浴30s，31℃水浴30s，用無菌剪刀剪斷麥管，斷端接一段帶空氣的注射器，剪斷另一端，將胚胎吹入空的器皿中，加入0.8ml的解凍液①，10min后依次移入0.8ml解凍液①＋②，解凍液②，解凍液②＋③，各5min，然后將胚胎移入解凍液③制成的微滴，逐滴漂洗，移入最后一個微滴中，37℃孵育10min后，移入胚胎培養液中；

所述的解凍液①為摩爾濃度為0.5M的蔗糖解凍液；解凍液②為摩爾濃度為0.?2M的蔗糖解凍液；解凍液③為HEPES-緩沖HTF含12mg/mlHSA；解凍液①＋②為解凍液①和解凍液②等體積混合的混合液；解凍液②＋③為解凍液②和解凍液③等體積混合的混合液；?

所述的胚胎培養液包括卵裂期胚胎培養液和囊胚培養液，卵裂期胚胎移入卵裂期胚胎培養液，囊胚期胚胎移入囊胚培養液中；所述的卵裂期胚胎培養液微滴為1ml體積濃度10%的血清替代品（市售產品，SAGE公司）加入9ml?Quinn’s-1026（市售產品，SAGE公司）配成卵裂期胚胎培養液，在35mm的培養皿中做25μL微滴，覆蓋2ml礦物油，置于35~38℃、體積濃度為4~6％的CO₂培養箱中平衡過夜；所述的囊胚培養液微滴為1ml體積濃度10%的血清替代品（市售產品，SAGE公司）加入9ml?Quinn’s-1029（市售產品，SAGE公司）配成囊胚培養液，在35mm的培養皿中做25μL微滴，覆蓋2ml礦物油，置于35~38℃、體積濃度為4~6％的CO₂培養箱中平衡過夜；

（2）飼養層細胞的制備：分別制備小鼠胚胎成纖維細胞和小兒包皮成纖維細胞

制備小鼠胚胎成纖維細胞：選取性成熟的昆明雌雄鼠，按性別比1:?1合籠，次日觀察雌鼠陰道口，見到陰栓即定為孕0.5天；斷頸處死孕12.5～14.5天的雌鼠，浸泡在盛有體積濃度為75%酒精的燒杯內1min，在無菌條件下暴露子宮，分離子宮系膜，剪斷子宮角，取出整個子宮，用含青霉素-鏈霉素（100IU/m1）的磷酸緩沖液漂洗3～5次；沿子宮系膜側剪開子宮，取出帶有胎膜的胚胎，用磷酸緩沖液充分漂洗，用鑷子撕破胎膜，取出胎鼠，磷酸緩沖液漂洗3遍，去除胎鼠頭尾、四肢和內臟，磷酸緩沖液漂洗其軀干3遍，充分去除紅細胞；用無菌眼科剪將鼠胚軀干剪成1mm³以下的碎塊，吸于離心管中，室溫下靜置5～10?min，棄上層液，留下胚胎組織碎塊；加入1ml?質量濃度為0.25%的胰酶，輕輕吹打30～60?s后，加入等體積的飼養層培養基終止消化，室溫下靜置5～10?min，收集上層細胞懸液，重復該步驟5～6次，每次消化后均收集上層單細胞懸液，最后一次消化后廢棄剩余組織塊；對收集到的單細胞懸液1000?rpm/min離心5min，棄上清，加入飼養層培養基，輕輕吹打，制備成均勻的單細胞懸液，接種至培養瓶內，混勻，標記培養日期，細胞名稱，編號等，置于35~38℃、體積濃度為4~6％的CO₂培養箱中培養，每天觀察，可見呈三角形或梭形的成纖維細胞；待細胞長滿即可根據實驗需要消化傳代或凍存復蘇；

制備小兒包皮成纖維細胞：取下的小兒包皮組織，立即放入提前4℃預冷的無菌生理鹽水的滅菌容器中；將包皮組織在含青霉素-鏈霉素（100IU/m1）的生理鹽水中反復充分漂洗，去除血跡；去除皮下的疏松結締組織，將皮片剪成0.5cm×0.5cm大小，磷酸緩沖液漂洗兩次；加入1ml質量濃度為0.25％的胰酶，4℃消化12?h后，加入等體積的飼養層培養基終止消化，分離真皮和表皮，37℃條件下Ⅰ型膠原酶（200?U/ml）消化真皮60min，加入飼養層培養基中和，收集細胞懸液離心，用飼養層培養基洗3次；將細胞懸液接種在培養瓶中，37℃、5%CO₂培養箱內培養，每天觀察，隔天換培養液，待細胞長滿則可根據實驗需要消化傳代或者凍存復蘇；

所述的消化傳代為：棄去培養皿中的飼養層培養基和未貼壁細胞，磷酸緩沖液漂洗2遍，加入3-5ml質量濃度0.25%胰酶消化，倒置顯微鏡下觀察，待細胞縮回偽足，變圓而未脫落時，吸出胰酶，加飼養層培養基中和；用吸管吸取培養基吹打瓶底至細胞完全脫落，將細胞懸液移至離心管中，1000?rpm/min離心5min，棄上清液，加入4-5ml飼養層培養基吹打均勻，按傳代比例1：3～1：5進行傳代，選用3～5代小鼠胚胎成纖維細胞或小兒包皮成纖維細胞作為飼養層細胞；

所述的凍存為：每天觀察培養瓶中小鼠胚胎成纖維細胞或小兒包皮成纖維細胞，待長至飼養層培養基的80～90%時，可準備凍存，漂洗、消化操作同上述消化傳代步驟；1000?rpm/min離心5min，棄上清，得到細胞沉淀，加入1-1.5ml冷凍保護液，輕輕吹打混勻，冷凍液中細胞密度為5～10×10⁶個/ml；將細胞懸液裝入冷凍管中，每管裝1.0ml，冷凍管標明細胞名稱，代數和凍存日期，依次置于4℃?30min，-20℃2h，-80℃?6～8h，投入液氮；

所述的復蘇為：從液氮中取出凍存管，輕輕旋松瓶蓋，氣浴30s后立即旋緊瓶蓋，投入37℃水浴中并不斷搖動使其融化；將凍存管內融化的細胞懸液移入離心管中，沿管壁緩慢加入3ml37℃預熱過的飼養層培養基，混勻，1000?rpm/min離心5min，棄上清；向細胞沉淀中加入5ml飼養層培養基，混懸后接種至培養瓶中，倒置顯微鏡下觀察見細胞為大小較均一的圓形，置于37℃、5%CO₂培養箱內培養；次日換液，觀察；

（3）混合飼養層的制備：

向培養皿中加入質量濃度為0.1%的明膠溶液，至覆蓋住培養皿皿底，室溫下靜置1.5~2.5小時，吸出明膠溶液，得明膠包被的培養皿，待用；收集步驟（2）中制備的小鼠胚胎成纖維細胞和小兒包皮成纖維細胞，經磷酸緩沖液漂洗后，分別避光條件下加入絲裂霉素C溶液，置于35~38℃、體積濃度為4~6%的CO₂培養箱中培養3~4小時后，除去培養瓶中的絲裂霉素C溶液，磷酸緩沖液漂洗5遍后分別加入2ml質量濃度為0.25%的胰酶，在倒置顯微鏡下觀察，待細胞偽足縮回，變圓而未脫落時，棄去胰酶，加入等體積的飼養層培養基終止消化，反復吹打瓶底使細胞脫落后，移至離心管內，1000?rpm/min離心5min，棄上清，得細胞沉淀，向離心管中分別加入2～4?ml的飼養層培養基吹打混勻，分別得小鼠胚胎成纖維細胞和小兒包皮成纖維細胞的細胞懸液；按照細胞個數1：1的比例混合小鼠胚胎成纖維細胞和小兒包皮成纖維細胞，得混合細胞懸液，按照0.60×10⁵個/cm²的密度，將上述混合細胞懸液均勻鋪在制備的明膠包被的培養皿中；培養皿放入35~38℃、體積濃度為4~6％的CO₂培養箱中，12h細胞貼壁后即可用做飼養層；

（4）人胚胎干細胞系的建立

采用常規的機械法分離步驟（1）所得的廢棄胚胎的內細胞團：取1ml注射器，在解剖顯微鏡下用注射器針頭將內細胞團周圍的滋養外胚層細胞切除，盡量避免損傷內細胞團；

傳代培養：根據細胞生長速度的差異，原代克隆生長3～7天傳代，之后每隔4～7天傳代1次，用1ml注射器的針頭在克隆上進行機械切割，切割時選取較致密厚實的克隆，棄去分化的克隆，用巴斯德吸管將切后的克隆接種到新制備的飼養層上，傳代比例1：3～1：5；

所述的飼養層培養基為440ml高糖DMEM，5ml非必需氨基酸，5ml青/鏈霉素，50ml胎牛血清經過0.22um濾器過濾，4℃保存。