[發明專利]一種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法

有效

• 申請號: 201210220615.6
• 申請日: 2012-06-29
• 公開（公告）號: CN102731612A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 林海萍;毛勝鳳;劉洪波
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: C07K1/30
• 分類號: C07K1/30;A01N63/04;A01P7/04;A01P17/00
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

1.?一種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法，其特征在于具體包括以下步驟：

1）將球孢白僵菌菌株接種在PPDA培養基上，于22-25℃培養箱中培養14-18d后，刮下分生孢子，用無菌水稀釋成0.8-1.2×108個·mL-?1?的孢子懸浮液，按孢子懸浮液:發酵培養基體積比為0.5-1.5:100的比例接種于發酵培養基上,再將其置于23-26℃、120-150rpm的恒溫振蕩培養箱里培養5.5-8d，備用；?

2）取步驟1）發酵液，3-5℃、3500-4500rpm離心10-15min，收集上清液，用3層濾紙真空抽濾，除去發酵液中懸浮的菌絲，收集的濾液得胞外全蛋白粗提液，備用；

3）取步驟2）胞外全蛋白粗提液，每100mL中加入10pL乙二胺四乙酸，并在冰浴條件下加入硫酸銨粉末至其飽和度達85-95％；同時用磁力攪拌器不斷攪拌以加速硫酸銨的溶解，控制加入速度使不起泡沫；最后，3-5℃下靜置過夜，而后將該粗提液3-5℃、9500-10000rpm離心10-15min,?棄上清液，將沉淀用其重量4-5%的0.04mol·L^-?1，pH?=6.6的磷酸緩沖液溶解，即得胞外全蛋白粗提濃縮液，備用；

4）取步驟3）胞外全蛋白粗提濃縮液裝入透析袋中，3-5℃下透析15-18h，透析液為稀釋3.5-4.5倍的0.04mol·L^-?1，pH?=6.6的磷酸緩沖液，透析后的濃縮液，經3-5℃、5000-6000rpm離心10-15min，棄沉淀，收集上清液，并經0.21-0.26μm細菌過濾器過濾除菌，最終所得濾液即為胞外全蛋白提取液。

2.?如權利要求1所述的一種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法，其特征在于：步驟1）中培養箱中的培養溫度為23-24℃，培養時間為15-16d，孢子懸浮液的濃度為1×10⁸個·mL-?1，恒溫振蕩培養箱的培養溫度為24-25℃，轉速為130-140rpm，培養時間6-7d。

3.?如權利要求1所述的一種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法，其特征在于：步驟2）中離心轉速為3800-4000rpm，離心時間為12-13min。

4.?如權利要求1所述的一種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法，其特征在于：步驟3）中離心轉速為9700-9900rpm，離心時間為12-13min，

如權利要求1所述的一種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法，其特征在于：步驟4）中透析溫度為4-4.5℃，透析時間為16-17h，離心轉速5500-5800rpm，離心時間12-13min。