[發明專利]一種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法

有效

• 申請號: 201210220615.6
• 申請日: 2012-06-29
• 公開（公告）號: CN102731612A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 林海萍;毛勝鳳;劉洪波
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: C07K1/30
• 分類號: C07K1/30;A01N63/04;A01P7/04;A01P17/00
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

技術領域

本發明屬于林業害蟲生物防治技術領域，具體為一種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法。?

背景技術

松墨天牛及其傳播的松材線蟲病對我國松林造成了非常嚴重的危害，防治松墨天牛和持續控制松材線蟲是林業工作者當前急需解決的一大難題。目前防治松墨天牛的方法主要有以下三種：化學防治、利用引誘劑防治天牛成蟲與生物防治。化學防治存在較大的負面影響。生物防治是一種環境友好型的植保技術，尋找可傳染并降低害蟲種群數量的病原微生物等生態控制因子顯得尤為重要。?

關于松墨天牛的防治研究，國內外做了大量的工作，歸納起來有以下幾條防治途徑。（1）化學防治：飛機空中施藥(成片林分面積在3萬hm2以上適用)和地面機械噴藥方式殺滅松墨天牛。日本于70年代始采用殺螟松（MEP）、倍硫磷（MPP）、西維因（NAC）等飛機噴灑，一天內可殺死80％天牛成蟲。江蘇采用3％殺螟松連續幾年噴灑，但效果不明顯。近些年來我國研究開發了長效緩劑型，先后有21％滅殺斃微膠囊，30％敵一馬微膠囊，DFM－21（溴氰菊酯一倍硫磷）與FFM－20（氰戊菊酯一倍硫磷）微膠囊等。南京林業大學曾開發出觸雷式微膠囊劑型，經小面積和飛防試驗效果較好。(2)利用引誘劑防治天牛成蟲：日本已開發天牛引誘劑商品以及不育劑商品，效果較好。廣東省和浙江省也開展了研究，并開發出自產的引誘劑，效果比日產的好,目前已在生產上使用。(3)生物防治：日本與我國采用球孢白僵菌和管氏腫腿蜂防治天牛幼蟲，取得了較好的成果。?

自然界中，松墨天牛往往還受到病原微生物的侵染而得病死亡。松墨天牛的天敵微生物資源比較豐富，主要有真菌、細菌和寄生性線蟲，其中最重要的是真菌類。利用微生物防治害蟲具有以下獨特的優點：(1)害蟲不易產生抗藥性，由于微生物殺蟲是多種因素和成分發揮作用，同時在與害蟲長期共同生活的過程中適應了昆蟲的防衛體系，昆蟲對病原微生物的免疫力長期保持低水平；(2)具有良好的環境安全性，對寄主有較強的選擇性，不殺害天敵和有益生物，一般對脊椎動物無害，有利于保護天敵，保持生態平衡；(3)昆蟲是各類病原體理想的培養基，病原體在昆蟲體內增殖，可通過病蟲或蟲尸擴散傳播，在時間和空間上具有擴散蔓延能力，通過再侵染，形成不同程度的流行病，便于引種定殖，達到持續控制害蟲的效果；(4)易于通過基因工程改造獲得致病力強的品系。因此，利用微生物控制松墨天牛越來越受到人們的關注和重視。?

發明內容

針對現有技術中存在的上述問題，本發明的目的在于設計提供一種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法的技術方案，其生產成本低，殺蟲和驅蟲效果好，且對環境影響小，對人體安全可靠。?

所述的一種防治松墨天牛的胞外全蛋白提取液的制備方法，其特征在于具體包括以下步驟：?

1）將球孢白僵菌菌株接種在PPDA培養基上，于22-25℃培養箱中培養14-18d后，刮下分生孢子，用無菌水稀釋成0.8-1.2×108個·mL-?1?的孢子懸浮液，按孢子懸浮液:發酵培養基體積比為0.5-1.5:100的比例接種于發酵培養基上,再將其置于23-26℃、120-150rpm的恒溫振蕩培養箱里培養5.5-8d，備用；?

2）取步驟1）發酵液，3-5℃、3500-4500rpm離心10-15min，收集上清液，用3層濾紙真空抽濾，除去發酵液中懸浮的菌絲，收集的濾液得胞外全蛋白粗提液，備用；

3）取步驟2）胞外全蛋白粗提液，每100mL中加入10pL乙二胺四乙酸，并在冰浴條件下加入硫酸銨粉末至其飽和度達85-95％；同時用磁力攪拌器不斷攪拌以加速硫酸銨的溶解，控制加入速度使不起泡沫；最后，3-5℃下靜置過夜，而后將該粗提液3-5℃、9500-10000rpm離心10-15min,?棄上清液，將沉淀用其重量4-5%的0.04mol·L^-?1，pH?=6.6的磷酸緩沖液溶解，即得胞外全蛋白粗提濃縮液，備用；

4）取步驟3）胞外全蛋白粗提濃縮液裝入透析袋中，3-5℃下透析15-18h，透析液為稀釋3.5-4.5倍的0.04mol·L^-?1，pH?=6.6的磷酸緩沖液，透析后的濃縮液，經3-5℃、5000-6000rpm離心10-15min，棄沉淀，收集上清液，并經0.21-0.26μm細菌過濾器過濾除菌，最終所得濾液即為胞外全蛋白提取液。