[發明專利]一種用于擴增短鏈RNA的引物及其相關方法

有效

• 申請號: 201210217137.3
• 申請日: 2012-06-26
• 公開（公告）號: CN103509789A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 劉曉光
• 申請（專利權）人: 劉曉光
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 寧波誠源專利事務所有限公司 33102
• 代理人: 袁忠衛

技術領域

本發明涉及分子檢測領域，特別涉及反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)中檢測全長為18-25nt的成熟miR所用的反轉錄引物的設計與應用技術領域。

背景技術

成熟miR是最近發現的一類全長為18-25nt的單鏈小分子非編碼RNA，是由莖環結構的轉錄前體(包括pri-miRNA約1000bp、pre-miRNA約60-70bp)加工而成。2011年11月Sanger?miRBase數據庫（18.0版）公布，發現了2萬多種轉錄本，包括人類的近2000種。miRNAs是Victor?Ambros及其同事首先在線蟲體內發現的，是一類非編碼的內源性單鏈小分子RNA。其5`端的2-8nt種子區域（seed?region）可與其靶mRNA的3`UTR以Waston-Crick堿基全部或部分互補配對（Watson-Crick?basepairing），從而發揮轉錄調控作用。人們預測大約30%的人類基因受miRNAs的調控，每種miRNA調控大約200種靶基因，而每種基因又受多種miRNA調控。各項研究亦表明它參與了人體重要的生物學進程，如發育、造血、器官形成、細胞分化、凋亡和增殖、癌癥發生等。隨著對miRNAs研究的日趨深入，眾多的研究數據顯示超過50%的miRNAs基因位于癌基因或脆性基因區域，發揮著癌基因或抑癌基因的作用，在多種癌癥中表達上調或降低。

第一篇有關miRNA的論文發表于1993年，隨后的十年間相關的研究論文相當有限，然而近5-6年來有關miRNA的研究論文數成倍增加，2010年大約就有近12000篇論文公開發表并且有文獻表明，成熟miRNA具有組織特異性、疾病特異性、存在于外周血且非常穩定。因此，miRNA不僅有治療價值而且有診斷價值。miRNA已經成為廣大學者研究的熱點，并逐漸向應用領域轉化。如何進行準確、特異地檢測miRNA成為首先要解決的問題。雖然miRNAs是一類表達相對豐富的轉錄本，但他們在不同物種和組織中的表達水平變化非常大。低豐度的miRNAs，通常用克隆、northern?blot和芯片的技術將難以檢測。如果要精確和定量檢測miRNA尤其是低豐度miRNA，qRT-PCR技術無疑是最佳選擇，因為實時熒光定量PCR技術是檢測基因表達的金標準。1985年，美國科學家Kary?Mullis在高速公路的啟發下，經過兩年的努力，發明了PCR技術，并在Science雜志上發表了關于PCR技術的第一篇學術論文。從此，PCR技術得到了生命科學界的普遍認同，Kary?Mullis也因此而獲得1993年的諾貝爾化學獎。PCR的基本工作原理就是以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復制的機理沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成。通過不斷重復這一過程，可以使目的DNA片段得到擴增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作為模板，因而PCR技術可使DNA的合成量呈指數型增長。

PCR是一種級聯反復循環的DNA合成反應過程。PCR技術的基本反應由三個步驟組成：

1.變性：通過加熱使模板DNA完全變性成為單鏈，同時引物自身和引物之間存在的局部雙鏈也得以消除；

2.退火：將溫度下降至適宜溫度，使引物與模板DNA退火結合；

3.延伸：將溫度升高，熱穩定DNA聚合酶以dNTP為底物催化合成DNA鏈延伸。

以上三步為一個循環，新合成的DNA分子又可以作為下一輪合成的模板，經多次循環后即可達到擴增DNA片段的目的。到目前為止，PCR技術已有十幾種之多，例如，將PCR與反轉錄酶結合，成為反轉錄PCR（RT-PCR）用于RNA的擴增，將PCR與抗體等相結合就成為免疫PCR等。

應用PCR技術檢測有一定長度（如100bp到幾個kb）的DNA或RNA，初學PCR的技術人員也不會有多大的困難，但是如何設計長度只有18-25nt的成熟miRNA的反轉錄引物、特異性的正向引物、標記染料的TaqMan探針和反向引物是解決miRNA定量RT-PCR檢測的關鍵所在。因為普通引物的理想長度在15-30bp之間，按照常規的做法一條成熟miRNA的長度就幾乎為引物鏈覆蓋了，這樣擴增將難以實現。目前解決這一問題的是美國的AB公司，她采用了一種莖環引物反轉錄成熟miR，來加長轉錄后的cDNA，實現PCR擴增檢測的目的。

在中國專利文獻庫檢索也沒有相關文獻。

發明內容