[發(fā)明專利]一種用于擴(kuò)增短鏈RNA的引物及其相關(guān)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210217137.3
• 申請日: 2012-06-26
• 公開（公告）號: CN103509789A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉曉光
• 申請（專利權(quán)）人: 劉曉光
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 寧波誠源專利事務(wù)所有限公司 33102
• 代理人: 袁忠衛(wèi)

1.一種用于擴(kuò)增短鏈RNA的引物，其引物共4條，分別為莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物、特異性正向引物、通用反向引物和通用探針，其特征是：莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物由5段不同長度的寡核苷酸組成，3`端的6-8bp組成第一區(qū)域與靶miR的3`端形成特異性互補(bǔ)，決定轉(zhuǎn)錄的特異性，第二區(qū)域（2）和第五區(qū)域（5）互補(bǔ)結(jié)合，形成引物內(nèi)部雙鏈結(jié)構(gòu)，其Tm值應(yīng)高于反轉(zhuǎn)錄最適溫度2-5℃，在反轉(zhuǎn)錄的過程中始終保持雙鏈形式，靠近核苷酸環(huán)狀結(jié)構(gòu)5`端的第四區(qū)域（4）設(shè)為通用反向引物區(qū)，其Tm值接近特異性正向引物或略高于3-10℃，靠近核苷酸環(huán)狀結(jié)構(gòu)3`端的第三區(qū)域（3）設(shè)為通用探針區(qū)，探針區(qū)的GC含量一般大于70%，保證探針的長度不超過20bp且Tm值高于特異性正向引物的Tm值3-10℃，第三區(qū)域（3）與第四區(qū)域（4）之間應(yīng)至少間隔3bp以上。

2.如權(quán)利要求1所述的一種用于擴(kuò)增短鏈RNA的引物，其特征在于：所述的莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物，其3`端和5`端分別有一段互補(bǔ)配對的序列長度15-20個核苷酸，并且3`端還有一段6-8個核苷酸的單鏈結(jié)構(gòu)，該單鏈與成熟的靶miR特異性互補(bǔ)配對。

3.如權(quán)利要求1所述的一種用于擴(kuò)增短鏈RNA的引物，其特征在于：所述通用探針區(qū)和通用反向引物區(qū)序列的Tm值接近或一致，并大于莖環(huán)引物內(nèi)部雙鏈Tm值2-5℃。

4.如權(quán)利要求1所述的一種用于擴(kuò)增短鏈RNA的引物，其特征在于：所述的特異性正向引物，其Tm值小于通用探針和通用反向引物Tm值3-10℃。

5.如權(quán)利要求1所述的一種用于擴(kuò)增短鏈RNA的引物，其特征在于：所述的通用反向引物，其序列與莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物的通用反向引物區(qū)序列一致。

6.如權(quán)利要求1所述的一種用于擴(kuò)增短鏈RNA的引物，其特征在于：所述的通用探針，其序列與莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物的通用探針區(qū)序列一致。

7.一種采用權(quán)利1-6的任意一種引物擴(kuò)增短鏈RNA的方法，其特征在于：

莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物在合適的溫度和反轉(zhuǎn)錄酶的作用下與靶miR的3`端特異性結(jié)合，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈；

特異性正向引物由3`端的特異性序列（7）和5`端的尾部序列（8）構(gòu)成，通用反向引物由莖環(huán)引物的通用反向引物區(qū)序列構(gòu)成，通用探針由莖環(huán)引物的通用探針區(qū)序列構(gòu)成；

經(jīng)過充分預(yù)變性后，當(dāng)退火溫度達(dá)到特異性正向引物特異性序列（7）的Tm值時，特異性正向引物與cDNA第一鏈（6）的3`端特異性結(jié)合，并在DNA合成酶的作用下延伸合成cDNA第二鏈（9）；

再變性后，cDNA第二鏈9與cDNA第一鏈6解鏈成單鏈，當(dāng)退火溫度達(dá)到通用反向引物和通用探針Tm值時，通用反向引物和通用探針與cDNA第二鏈（9）配對結(jié)合，在DNA合成酶的作用下通用反向引物以cDNA第二鏈（9）為模板延伸形成cDNA第二鏈（9）的互補(bǔ)鏈，同時當(dāng)延伸到通用探針時，通用探針被水解，通用探針兩端的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開，熒光基團(tuán)發(fā)出熒光，實(shí)現(xiàn)定量檢測。

8.如權(quán)利要求7所述擴(kuò)增短鏈RNA的方法，其特征在于所述莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物其3`端和5`端分別有一段互補(bǔ)配對的序列長度15-20個核苷酸，該互補(bǔ)雙鏈的Tm值應(yīng)大于反轉(zhuǎn)錄最適溫度2-5℃。

9.如權(quán)利要求7所述擴(kuò)增短鏈RNA的方法，其特征在于所述通用探針區(qū)和通用反向引物區(qū)序列的Tm值接近或一致，并大于莖環(huán)引物內(nèi)部雙鏈Tm值2-5℃。

10.如權(quán)利要求7所述的擴(kuò)增短鏈RNA的方法，其特征在于：所述cDNA第二鏈的合成的退火溫度為60-65℃，PCR擴(kuò)增循環(huán)的退火溫度為65-70℃。