[發明專利]一種快速測定乳酸菌發酵產物有機酸種類和產量的方法

有效

• 申請號: 201210216725.5
• 申請日: 2012-06-27
• 公開（公告）號: CN102721781A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 劉媛媛;汪攀;張軍;王安如
• 申請（專利權）人: 北京大北農科技集團股份有限公司;吉林大北農農牧科技有限責任公司;漳州大北農農牧科技有限公司
• 主分類號: G01N30/89
• 分類號: G01N30/89
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及乳酸菌發酵產物檢測領域，特別涉及一種快速測定乳酸菌發酵產物有機酸種類和產量的方法。

背景技術

目前對乳酸菌發酵液中有機酸種類和產量的測定還沒有統一的標準。故建立一種快速測定乳酸菌產有機酸產量的方法具有重要的意義。乳酸菌的培養基中一般以糖類物質作為碳源，在細菌生長代謝過程中會將培養基中的碳源物質分解成為甲酸、乙酸、丙酸、乳酸等有機酸，測定這些有機酸的成分、含量及其在發酵過程中的變化，對了解乳酸菌的代謝特性和發酵過程中代謝產物的監控都是非常有用的。目前，有機酸的檢測方法主要有分光光度法、酶法、薄層色譜法、氣相色譜法、離子色譜法和液相色譜法。分光光度法是以有機酸和一些特定物質反應能生成有色物質為機理測定有機酸含量，該法易受干擾，通常需要將提取液進行沉淀、離子交換樹脂等前處理，步驟繁冗。酶法雖然特異性較強，能夠測定有機酸的構型，但是每次只能測定一種有機酸，比較耗時。氣相色譜法不僅需要通過液液萃取將有機酸萃取到有機相中，還需進行柱前衍生化以提高其揮發性，且常因為衍生化反應不易定量而直接影響測定結果的準確性。離子色譜法雖然對于樣品預處理的要求比較簡單，但高濃度的無機離子可能會干擾有機酸根離子的測定。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供一種快速測定乳酸菌發酵產物有機酸種類和產量的方法。

本發明的快速測定乳酸菌發酵產物有機酸種類和產量的方法，包括分別制備樣品溶液和標準品溶液，用反相HPLC梯度洗脫法測定乳酸菌發酵產物中有機酸的種類和含量，其中，流動相A液為甲醇，流動相B液為0.01M的磷酸二氫鈉水溶液，0~9.5min為100%B液，9.5~10min?A液升至55%，B液降至45%，10~13min保持55%A液，45%B液，13~15min?A液降至45%，B液升至55%，15~25min保持55%A液，45%B液，25~28min?B液升至100%，28~30min保持100%B液。

其中，所述的反相HPLC的色譜條件為：色譜柱為C18柱，250mm×4.6mm，5μm，采用低壓梯度洗脫，檢測波長為215nm，柱溫30~40℃，采樣時間為30min。優選地，所述的柱溫為35℃。

其中，所述的樣品溶液制備方法為：取乳酸菌發酵液1mL，加入體積分數50%的硫酸200μL，10000r/min離心5min，取上清液100μL稀釋至500μL，經0.45μm濾膜過濾。

其中，所述的標準品溶液制備方法為：分別取有機酸標準品，加入水配成50mg/mL、100mg/mL或150mg/mL母液備用，使用時混合并稀釋至所需濃度，經0.45μm濾膜過濾。所述的標準品為酒石酸、氨基丁酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、丙酸、丁酸。

其中，梯度洗脫流速0~10min為0.7mL/min，10~30min為1mL/min。

其中，所述的0.01M磷酸二氫鈉水溶液pH值為2.8~3.0。

其中，進樣量為10μL。

本發明采用反相HPLC低壓梯度洗脫測得乳酸菌發酵產有機酸種類和含量，可以做到7種有機酸基線分離、峰形良好。本發明方法簡便、迅速，靈敏度高，重現性好。

附圖說明

圖1為7種有機酸混合標準品色譜圖。

圖2為干酪乳桿菌發酵液色譜圖。

圖3為植物乳桿菌發酵液色譜圖。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。

實施例1標準品的HPLC

1.儀器與樣品

LC-20A（日本島津）高效液相色譜儀，BT25S型電子天平（d=0.01mg賽多利斯科學儀器（北京）有限公司），KQ5200B型超聲清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；色譜甲醇（Fisher?Scientific），水（18.2MΩ.cm?Millipore?Rios系列），其他試劑均為分析純。

乳酸菌發酵產有機酸標準品為酒石酸、氨基丁酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、丙酸、丁酸（Sigma試劑）。

2.方法與結果

2.1標準品溶液的制備

分別取有機酸標準品，加入超純水配成100mg/mL或50mg/mL、150mg/mL母液備用，使用時混合并稀釋至所需濃度，經0.45μm濾膜過濾后分析。

2.2色譜條件與系統適用性試驗