[發明專利]帶魚抗氧化肽的制備方法

無效

• 申請號: 201210215984.6
• 申請日: 2012-06-25
• 公開（公告）號: CN102747125A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發明（設計）人: 吳惠岳;靳挺;周斌;武玉學
• 申請（專利權）人: 寧波武盛化學有限公司
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;B01D61/14
• 代理公司: 寧波市鄞州甬致專利代理事務所(普通合伙) 33228
• 代理人: 代忠炯

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體是指一種以帶魚為原料，通過復合酶水解帶魚蛋白質，酶解－膜分離耦合制備抗氧化肽的方法。

技術背景

帶魚又名刀魚、牙帶魚，是魚綱鱸形目帶魚科動物，是我國沿海產量較高的一種經濟魚類，味道鮮美，深受國內外消費者的青睞。帶魚具有較高的營養價值，對病后體虛、產后乳汁不足和外傷出血等癥具有一定食療作用。中醫認為它具有和中開胃、暖胃補虛、潤澤肌膚及美容等功效。帶魚體內蛋白質含量高，并且帶魚蛋白質是一種全價蛋白質，含有人體必需的八種氨基酸；還含有鈣、磷、鐵等微量元素，營養豐富。然而，隨著捕撈強度的增大，海洋捕撈的小帶魚產量呈逐年上升趨勢；小帶魚由于體型小，直接食用的價值較低；現在主要用來生產魚粉等低值產品，更有作為廢棄物直接丟棄，導致資源未得到充分利用，經濟效益低下，甚至污染環境。

自從Harman提出自由基理論以來，人們逐漸認識到人體內氧化產生的自由基與人的衰老和許多疾病有關。抗氧化劑通過清除自由基，調整和改善人體生理功能，從而達到預防和治療慢性疾病的目的。由于化學合成抗氧化劑的不安全性，高效、無毒的天然抗氧化劑成為開發研究的重點。進一步研究發現，抗氧化肽具有活性強、安全性高的優點，成為研究的熱點。天然蛋白質特別是海洋蛋白質，基于生長環境的特異性，其多肽鏈中存在功能、結構新穎的活性片段；采用酶工程的技術手段水解蛋白質，釋放有生物活性的抗氧化肽，已成為制備抗氧化肽的一種重要方法。抗氧化肽的活性與其結構密切相關，而結構取決于氨基酸序列和分子量大小。一般來說，分子量低于3000Da的肽類具有更高的抗氧化活性。低分子量抗氧化肽以其抗氧化能力強、較氨基酸更易為人體所吸收等優點，已廣泛應用于醫藥及保健食品等行業。

酶解－膜分離耦合技術可在酶解的同時利用膜對酶解產物進行分離，目標肽被分離出來，酶、大分子多肽和蛋白則返回到反應體系中繼續酶解。這種技術具有顯著的優點：通過產物的在線分離，減少產物抑制效應和過度降解，提高產物活性；通過酶的循環使用，提高酶的利用率。

目前，國內已有人采用酶法水解制備抗氧化肽報道，但現有技術多使用一種酶水解。其美中不足是，由于僅采用一種酶水解蛋白質，并且在制備抗氧化肽的過程中，采用的超濾膜的截留分子量為5000Da～10000Da；導致得到的抗氧化肽的抗氧化能力較低，超氧陰離子自由基清除率僅為24.8～28.2％；DPPH自由基清除率也只有40.2～47.1％。

發明內容

本發明針對現有技術的上述不足，提供一種能充分利用原材料、獲得具有較高抗氧化能力的帶魚抗氧化肽的制備方法。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為：一種帶魚抗氧化肽的制備方法，包括以下步驟：

（1）將帶魚去頭、尾和內臟，洗凈稱重，加入1～3倍帶魚質量的水，絞碎成均勻的魚肉漿；

（2）將步驟（1）制備的魚肉漿放入酶解罐中，添加帶魚質量0.2%～0.9%的內切蛋白酶，調溫至45～70℃，調pH至5.5～8.5，攪拌水解8～14h，得水解液；

（3）將步驟（2）所得水解液離心：4100~4500rpm、2~6℃、12～14分鐘，取上清液；

（4）將步驟（3）的上清液經過0.45um（微米）的微孔濾膜進行微濾后放入酶解罐，然后添加帶魚質量0.1%～0.9%的外切蛋白酶，調溫至40～55℃，調pH至5.0～8.0，攪拌水解7～10h；

在上述水解過程中將酶解液從酶解罐中泵入超濾膜分離器，使酶解液以0.1～0.5L/min的流量循環；調節超濾膜的壓力為0.07～0.09Mpa，超濾膜的截留分子量為3000Da，進行酶解－膜分離耦合反應；小于膜截留分子量的分子透過膜，未透過部分則返回酶解罐繼續酶解，反應過程中每隔10~15分鐘向酶解罐中補加水，以保持反應體系體積恒定，收集超濾膜透過液；

（5）反應結束后，將收集的超濾膜透過液，減壓濃縮至原體積的1/10～1/5，-18~-20℃預凍過夜，-60~-65℃、0.005~0.0054mbar（毫巴）冷凍干燥22~24h，即得到帶魚抗氧化肽。

步驟（2）所述的內切蛋白酶為木瓜蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶或Alcalase堿性蛋白酶；酶解過程中保持溫度和pH的恒定。

步驟（4）所述外切蛋白酶為Flavourzyme風味蛋白酶、氨肽酶或羧肽酶；酶解過程中保持溫度和pH的恒定。

本發明上述帶魚質量指的是步驟（1）將帶魚去頭、尾和內臟，洗凈稱重后的帶魚質量。