[發(fā)明專利]用于試樣的圖像顯示方法及其光學顯微設備

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210212564.2
• 申請日: 2012-06-21
• 公開（公告）號: CN102841079B
• 公開（公告）日: 2017-03-01
• 發(fā)明（設計）人: J·弗林格
• 申請（專利權）人: 徠卡顯微系統(tǒng)復合顯微鏡有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G02B21/36
• 代理公司: 北京泛華偉業(yè)知識產(chǎn)權代理有限公司11280
• 代理人: 王勇,王博

技術領域

本發(fā)明涉及一種應用權利要求1的前序部分的光學顯微設備以進行試樣圖像顯示的方法。本發(fā)明還涉及一種根據(jù)權利要求9的前序部分的光學顯微鏡設備。

背景技術

近來研發(fā)了光學顯微成像方法，通過所述方法，試樣能夠基于單一標記物，特別是熒光分子的有序的、隨機的定位而被顯示，所述試樣比常規(guī)的光學顯微鏡的基于衍射的分辨極限更小。例如在文獻WO2006/127692A2；DE102006021317?B3；WO2007/12843?A1；US2009/0134342?A1；DE102008024568?A1；“Sub-diffraction-limit?imaging?by?stochastic?optical?reconstruction?microscope(STORM)”，Nature?Methods?3,793-796(2006)，M.J.Rust,M.Bates,X.Zhuang；“Resolution?of?Lambda/10in?fluorescence?microscopy?using?fast?single?molecule?photo-switching”，Geisler?C.et?al,Appl,Phys.A,88,223-226(2007)中描述了這類方法。這種新的顯微術分支也稱為定位顯微術。在文獻中，所述應用的方法以如下標記被公開，例如：(F)PALM((Fluorescence)Photoactivation?Localization?Microscopy（熒光）光敏定位顯微鏡),PALMIRA(PALM?with?Independently?Running?Acquisition具獨立運行采集器的PALM),GSD(IM)(Ground?State?Depletion?Individual?Molecule?return)Microscopy基態(tài)損耗（單分子返回）顯微鏡)或(F)STORM((Fluorescence)Stochastic?Optical?Reconstruction?Microscopy（熒光）隨機光重建顯微鏡)。

這類新方法的共同點在于利用標記物處理待成像的試樣，所述標記物具有兩種狀態(tài)，即“亮”態(tài)和“暗”態(tài)。例如當使用熒光染料作為標記物時，則亮態(tài)是能發(fā)熒光的狀態(tài)，而暗態(tài)是不能發(fā)熒光的狀態(tài)。為了以比成像光學系統(tǒng)的常規(guī)分辨極限更高的分辨率對試樣進行成像，就要使小部分量的標記物重復轉(zhuǎn)變成亮態(tài)。該“活性”的部分量形成標記物結(jié)構(gòu)，其各個轉(zhuǎn)變成亮態(tài)的標記物相互之間的平均間距大于成像光學系統(tǒng)的分辨極限。該各標記物結(jié)構(gòu)在空間分辨圖像傳感器上成像，該圖像傳感器以檢測在空間上相互可分開的光分布的形式來檢測該各標記物。

以此方法攝取大量單一圖像，在這些單一圖像中總是成像有另一種標記物結(jié)構(gòu)。在圖像分析過程中由此確定每個單一圖像中所述光分布的重心位置，該重心位置顯示了處于亮態(tài)的標記物。將由原始數(shù)據(jù)-單一圖像測算出的光分布的重心位置以全圖形式匯總到總圖示中。通過該總圖示產(chǎn)生的高分辨率的全圖反映出標記物的分布。

為了有代表性地重現(xiàn)該待測試樣，必須探測到足夠多的標記物信號。但是，因為在各活性標記物結(jié)構(gòu)中標記物的數(shù)目被處于亮態(tài)的兩標記物相互間所必需的最小平均間距所限，所以需攝取非常多的單一圖像，以使該試樣充分成像。通常單一圖像的數(shù)目為10000-100000。

攝取單一圖像所需的時間的下限被該圖像傳感器的最大圖像攝取速率所限。這導致了用于總圖示所需的單一圖像序列的總攝取時間相對較長。因此所述總攝取時間可達數(shù)小時。

在這樣長的總攝取時間內(nèi)，會產(chǎn)生導致待成像試樣相對于成像光學系統(tǒng)發(fā)生偏移的熱效應，例如光顯微鏡機械部件的熱膨脹、收縮或應變。由于為了完成高分辨率的全圖而按重心規(guī)定匯總所有的單一圖像，所以在攝取兩個相繼的單一圖像時出現(xiàn)的試樣和成像光學系統(tǒng)之間的所有相對移動均惡化該全圖的位置分辨率。

上述的問題可在下面按附圖1至4闡明。

圖1示出常規(guī)的倒置光學顯微鏡10的簡圖。該倒置光學顯微鏡10具有支架12，其上安置有載物臺14。在載物臺14上安置試樣固定件15，待成像的試樣16布置在所述試樣固定件上。