[發明專利]一種以水稻秸稈為主要原料固態發酵產纖維素酶的方法

有效

• 申請號: 201210211315.1
• 申請日: 2012-06-26
• 公開（公告）號: CN103509771B
• 公開（公告）日: 2017-05-17
• 發明（設計）人: 李洪兵;張峰;張明
• 申請（專利權）人: 湖南鴻鷹祥生物工程股份有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N1/14;C12R1/885
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明提供了一種以水稻秸稈為主要原料固態發酵制備纖維素酶的方法，采用的發酵菌株是2012年6月5日保存于中國典型培養物保藏中心的保藏編號為：CCTCC NO：M 2012204的里氏木霉(Trichoderma reesei)QZ-5菌株，該發明的特點是以農產品廢棄物-水稻秸稈為主要原料固態發酵制備纖維素酶，采用國際理論應用化學協會(IUPAC)推薦的國際標準方法測定酶活，即濾紙酶活力FPA測定，每克秸稈固態發酵后，其液體粗酶液的最高酶活可達4IU/g以上，所產纖維素酶可廣泛應用于能源、紡織、造紙、飼料、食品等領域，屬于生物技術領域。

背景技術

纖維素酶是一類能夠降解纖維素成葡萄糖的多組分復合酶系，可廣泛應用于能源、紡織、造紙、飼料、食品等領域，近年來，隨著全球資源能源短缺問題日顯突出，纖維素酶是將自然界中分布最廣、含量最多、最為廉價的纖維素作為再生資源的主要酶之一，從而使生產制備纖維素酶的研究成了全球科研工作者更關注的課題。

然，現有纖維素酶制備的研究表明，纖維素酶的制備成本偏高，由于纖維素酶屬于誘導酶類，純纖維素通常被認為是纖維素酶合成的最佳誘導物，但純纖維素價格昂貴，而農村水稻秸稈來源廣泛，是農產品廢棄物，本身既是纖維素又能作為微生物生長的碳源，這促使我們去探索研究變廢為寶、低成本制備纖維素酶的方法，本發明就是在這樣的指導思想下，經過無數次的試驗獲得成功的。

發明內容

本發明提供了一種以水稻秸稈為主要原料固態發酵制備纖維素酶的方法，采用的發酵菌株是2012年6月5日保存于中國典型培養物保藏中心的保藏編號為：CCTCC NO：M 2012204的里氏木霉(Trichoderma reesei)QZ-5菌株，該發明的特點是以農產品廢棄物-水稻秸稈為主要原料固態發酵產制備纖維素酶，采用國際理論應用化學協會(IUPAC)推薦的國際標準方法測定酶活，即濾紙酶活力FPA測定，每克秸稈固態發酵后提取的液體粗酶液的最高酶活可達4IU/g以上，所產纖維素酶可廣泛應用于能源、紡織、造紙、飼料、食品等領域，屬于生物技術領域。

本發明的技術方案：2012年6月5日保存于中國典型培養物保藏中心的保藏編號為：CCTCC NO：M 2012204的里氏木霉(Trichoderma reesei)QZ-5菌株為生產出發菌株，經種子培養和是以農產品廢棄物-水稻秸稈為主要原料固態發酵生產制備纖維素酶，工藝為：

(1)種子培養基：葡萄糖20g/L，馬鈴薯200g/L。

200g/L馬鈴薯的制備：馬鈴薯去皮、切片后，取200g加1.5升水，煮沸20分鐘，沙布過濾取濾液，定容到1升。

接種工藝：取保藏編號為CCTCC NO：M 2012204的里氏木霉(Trichoderma reesei)QZ-5斜面菌種一支加入0.9％的生理鹽水10ml，用竹簽刮下培養基上的孢子，即為菌種孢子液，取1ml菌種孢子液放入含50ml種子培養基的250ml的三角中，置于搖床。培養條件：轉速200rpm，溫度28℃，恒溫培養50小時，即為發酵產酶的種子液。

(2)發酵產酶培養基

將水稻秸稈切成1厘米左右的小段，稱20克放入500ml的三角瓶中，加入用醋酸和氫氧化鈉調的溶液酸堿度pH值為4.8的水50ml，121℃滅菌20分鐘，冷卻后待用。

(3)發酵產酶及酶液提取

在滅菌冷卻后的發酵產酶培養基中加入5ml種子培養液并充分混合，28℃環境中靜止培養9天，再加入200ml水，用棒充分攪散后，將500ml三角瓶置于溫度為28℃轉速為200rpm的搖床上搖3小時，過濾得到酶液，用FPA測定法測酶活。

(4)酶活的測定方法：

采用國際理論應用化學協會(IUPAC)推薦的國際標準方法測定酶活，即濾紙酶活力FPA測定。其定義為：在50℃，pH4.8的條件下，一個FPA國際單位等于酶水解反應中每分鐘由濾紙生成1.0Uumol葡萄糖的酶量，以國際單位IU表示，濾紙酶活單位可以用體積表示IU/ml，其方法與步驟為：

(1)將1×6cm的濾紙條WhatmanNo.1濾紙條卷成圓筒，橫放在10mL比色皿試管底部，(不要垂直放下，不要使濾紙貼在試管壁上)。

(2)向試管中加入1ml pH＝4.8的濃度為0.05mol/L的檸檬酸鈉緩沖液。

(3)將V體積的酶液加入到5mL的緩沖液中，適當的稀釋。然后將0.5mL的酶稀釋液加入到比色皿試管中。緩沖液作為空白。