[發(fā)明專利]一種利用重組Bacillus subtilis全細(xì)胞轉(zhuǎn)化AD生成ADD的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201210210431.1
• 申請日: 2012-06-20
• 公開（公告）號: CN102703494A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 饒志明;許正宏;張溫清;邵明龍;徐美娟;張顯;李會
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N1/21;C12P33/02;C12R1/32;C12R1/125
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技術(shù)領(lǐng)域

一種利用重組Bacillus?subtilis全細(xì)胞轉(zhuǎn)化AD生成ADD的方法，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。?

技術(shù)背景

甾體藥物可通過全合成或?qū)μ烊荤摅w化合物的降解和其官能團(tuán)的轉(zhuǎn)化獲得，甾體藥物具有很強(qiáng)的抗感染、剛過敏、抗病毒和抗休克等藥理作用。隨著時代的不斷發(fā)展，甾體藥物已經(jīng)成為僅次于抗生素的第二大類藥物，2000年甾體藥物在全球藥物市場的銷售額已突破200億美元，約占世界醫(yī)藥總銷售額的6％。?

甾體激素類藥物分類：腎上腺皮質(zhì)激素，包括氫化可的松，強(qiáng)的松等。可治療阿狄森氏癥，抗炎，抗過敏，抗休克的等；蛋白同化激素，其主要生理功能是抑制蛋白異化和促進(jìn)蛋白合成，主要用于治療蛋白質(zhì)增加和合成不足引起的疾病；性激素，包括雌性激素、雄性激素和孕激素。?

早期合成甾體藥物的原料大多從動物組織液中直接提取，由于這些原料的含量低、來源少、合成路線復(fù)雜、回收率低、代價高昂，不能滿足生產(chǎn)的需要。薯蕷皂素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，為甾體藥物的工業(yè)化生產(chǎn)提供了豐富而又廉價的原料，但是生產(chǎn)過程需要消耗大量的薯蕷皂素，使皂素價格不斷上升，增加了生產(chǎn)成本，且生產(chǎn)過程嚴(yán)重污染環(huán)境。?

近年來，薯蕷皂苷元的日益枯竭，各國都在積極尋找新的資源或新方法。植物甾醇作為新的資源為甾體工業(yè)注入了新的生命力，并可以從一些廢油的下腳料和各類農(nóng)作物中獲得。可以通過微生物選擇性邊鏈降解獲得重要的甾體藥物中間體AD和ADD。可以說目前幾乎所有甾體激素藥物都是以AD或ADD作為起始原料進(jìn)行生產(chǎn)的。微生物法具有成本低、對環(huán)境溫和等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到人們的重視。世界先進(jìn)國家目前進(jìn)行甾體藥物制備，大多以動植物甾醇為起始原料進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，得到AD和ADD后，再進(jìn)一步制備。?

3-甾酮-Δ¹-脫氫酶(3-ketosteroid-Δ¹-dehydrogenase，KSDD或KSTD)也稱C1，2位脫氫酶，它是甾體母核降解的關(guān)鍵酶，屬于黃素蛋白酶類，位于細(xì)胞膜上，能在甾體母核C1和C2之間引入雙鍵，提高原有底物的抗炎活性及經(jīng)濟(jì)價值，實(shí)現(xiàn)AD向ADD轉(zhuǎn)化，在甾體藥物開發(fā)上發(fā)揮著重要作用。對3-甾酮-Δ¹-脫氫酶(KSDD)的深入研究對整個甾體藥物行業(yè)的發(fā)展意義深遠(yuǎn)。生產(chǎn)更高附加值的ADD最直接有效的方法就是以4-AD為底物，通過微生物一步轉(zhuǎn)化。?

近年來，眾多學(xué)者成功實(shí)現(xiàn)了來源于不同菌株的KSDD的外源表達(dá)。不同來源的KSDD在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)時，主要以無活性的包涵體形式存在，檢測不到KSDD酶活或者酶活水平較低。本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)現(xiàn)了分枝桿菌的KSDD在大腸桿菌體系中的表達(dá)，以無活性的包涵體形式存在，未檢測到酶活與相關(guān)報道的一致。?

本發(fā)明通過質(zhì)粒pMA5，實(shí)現(xiàn)了分枝桿菌KSDD在枯草芽孢桿菌168中的可溶性過量表達(dá)，酶活達(dá)1.75U/mg，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化AD?12h后轉(zhuǎn)化率達(dá)65.7％。分枝桿菌KSDD在枯草系統(tǒng)中表達(dá)及全細(xì)胞轉(zhuǎn)化AD均為首次報道，且重組子表達(dá)的酶活及AD的轉(zhuǎn)化率均較高。枯草?芽孢桿菌作為安全穩(wěn)定的工業(yè)生產(chǎn)菌株，培養(yǎng)條件簡單，發(fā)酵周期短，成為微生物甾醇發(fā)酵工業(yè)潛在生產(chǎn)菌株。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供：通過基因工程手段來獲得具有全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)ADD能力的微生物的方法。對構(gòu)建的重組菌株進(jìn)行酶活力及發(fā)酵性能進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)3-甾酮-Δ¹-脫氫酶活力為出發(fā)菌的6倍左右，并且得到了較高的轉(zhuǎn)化率。為微生物發(fā)酵生產(chǎn)ADD的工業(yè)化提供了有益的指導(dǎo)。?

本發(fā)明的技術(shù)方案：是以基因工程為手段構(gòu)建一株全細(xì)胞轉(zhuǎn)化AD生成ADD重組枯草芽孢桿菌，以TLC及HPLC為方法檢測發(fā)酵液中產(chǎn)物的生成，篩選陽性重組子，通過酶活力和發(fā)酵性能的檢測來確定其目標(biāo)酶的活力及底物轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明成功構(gòu)建了一株以4-AD為底物全細(xì)胞轉(zhuǎn)化為方法的高產(chǎn)ADD的枯草芽孢桿菌工程菌株，其3-甾酮-Δ¹-脫氫酶活力和底物轉(zhuǎn)化率較出發(fā)菌株有較大提高。?

主要試劑：AD，ADD購自美國SIGMA公司?

重組菌株構(gòu)建方法：?

(1)3-甾酮-Δ¹-脫氫酶(KSDD)基因全序列的克隆?