[發明專利]敲除脯氨酸合成途徑提高鈍齒棒桿菌精氨酸產量的方法

無效

• 申請號: 201210210421.8
• 申請日: 2012-06-20
• 公開（公告）號: CN103173466A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 饒志明;許正宏;徐美娟;孫紅梅;竇文芳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/10;C12N1/21;C12P13/10;C12R1/15
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及工業微生物生產精氨酸的方法。更具體的，本發明涉及基因工程重組鈍齒棒桿菌生產精氨酸的方法。

背景技術

L-精氨酸是人體和動物體內的半必需堿性氨基酸，是合成蛋白質肌酸的重要原料，也是生物體尿素循環的一種重要中間代謝產物，具有多種獨特的生理和藥理作用。L-精氨酸在臨床醫藥、食品、化妝品以及有關生物研究領域中用途廣泛。發酵法是目前L-精氨酸商業化生產比較有效和經濟的方法。

隨著我國醫藥營養水平的提高，對精氨酸的需求日益增長，但傳統生產L-精氨酸的高產菌株大多采用誘變篩選的方法獲得，但此法有盲目性高、工作量大，且存在突變株生理失調、易退化等局限性；DNA重組技術出現以后，人們開始探索利用DNA重組技術調控合成精氨酸代謝途徑，以達到提高精氨酸產量的目的。鈍齒棒桿菌(Corynebacterium?crenatum)是我國研究者分離到的一種鈍齒狀、無芽孢的革蘭式陽性菌，其突變株在國內氨基酸生產中被廣泛應用，但對其遺傳背景的研究還處于空白狀態。C.crenatum?SYPW是本實驗室篩選得到的高產精氨酸突變菌株(菌株的保藏編號為CCTCC?NO：M208133)，SYPA?5-5是此菌株經過傳代5次后得到的菌株，其菌株特性在傳代中與SYPW保持一致。

對氨基酸生產菌株代謝途徑及代謝網絡進行有目的的改造從而提高氨基酸的產量是現代工業生物技術的一個主攻目標。對目標菌株進行遺傳改造時，經常涉及到多個基因的連續敲除，利用枯草桿菌中sacB基因作為一個條件致死型標記，攜帶抗生素抗性與sacB雙標記的新型整合型載體pK18mobsacB，對谷氨酸棒狀桿菌染色體基因實現了多基因的無痕敲除及基因替代，促進了棒桿菌屬的一系列菌株的遺傳改造，為棒桿菌代謝工程改造提供了良好的遺傳改造手段。

發明內容

本發明主要針對精氨酸合成的競爭旁路代謝關鍵酶基因進行敲除，以增強目標產物精氨酸合成途徑關鍵酶基因簇表達的同時，削弱脯氨酸合成競爭支路途徑的代謝流，最終使L-谷氨酸分解代謝集中在L-精氨酸的合成代謝流從而進一步提高精氨酸的產量。

通過對L-精氨酸合成代謝途徑的分析，代謝工程改造L-精氨酸生產菌株的另一育種方案就是削弱葡萄糖→L-谷氨酸→L-精氨酸代謝相關競爭途徑中的分支代謝流，使得更多的代謝流向合成L-精氨酸及其前體物L-谷氨酸。在鈍齒棒桿菌L-精氨酸的合成代謝途徑中，以葡萄糖為底物，經過TCA循環中的α-酮戊二酸合成L-谷氨酸，在基因簇argCH編碼的7個酶的催化下合成L-精氨酸。而L-Glu除作為合成L-精氨酸的前體物，其代謝流還可以向L-脯氨酸和L-谷氨酰胺合成。對C.crenatum?SYPA(相關菌株的保藏編號為CCTCC?NO：M208133)發酵L-精氨酸來說，應削弱旁路代謝流量而集中葡萄糖經TCA循環中的α-酮戊二酸→L-谷氨酸→L-精氨酸的代謝流量，因此本發明將對L-精氨酸合成相關競爭途徑——脯氨酸的合成進行敲除，根據模式菌株谷氨酸棒桿菌全基因組中proB基因(GenBank?No.BA000036.3)設計鈍齒棒桿菌中L-脯氨酸合成proB基因的敲除，從而提高了鈍齒棒桿菌發酵產L-精氨酸的產量而完成了本發明，目前相關研究暫無報道。

技術方案如下：

(1)以鈍齒棒桿菌基因組為模板，分別以proB基因上下游引物進行PCR擴增，其引物序列如下：

PproBF?EcoRI?5’-CGCGAATTCATGCGTGAGCGCATCTCCAACGC

PproBR?SalI?5’-CGCGTCGACTTACGCGCGGCTGGCGTAGTTGGAC

PCR獲得長為1,100bp的目標特異產物，經純化后與pMD18-T連接，轉化JM109，提取質粒，酶切驗證并測序。

(2)設計引物利用重疊PCR的方法擴增缺少了300～500bp的缺失型基因proB’，引物序列如下：

PΔproB?R5’-CCCATCCACTAAACTTAAACACGCACGATCACGCTTTCCTGCATC

P?ΔproB?F?5’-TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGTGTCTGCTGCACGTTTGGCT

經兩輪重疊PCR獲得核苷酸片段經瓊脂糖凝膠電泳檢測，圖1所示為含同源片段proB’與理論大小一致，缺失片段構建成功；將目的片段proB’與pK18mobsacB線性化載體相連構建重組質粒，轉化E.coli?JM109，并挑取陽性轉化子。