[發明專利]一種木糖醇基因工程菌及其混合轉化生產木糖醇的方法

有效

• 申請號: 201210209060.5
• 申請日: 2012-06-25
• 公開（公告）號: CN102936576A
• 公開（公告）日: 2013-02-20
• 發明（設計）人: 齊向輝;郭齊;王飛;鄧文穎;王亮;孫文敬;陳華友;蒙健宗;張云光
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P39/00;C12P19/02;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

技術領域

本發明涉及生物技術領域，涉及一種木糖醇基因工程菌的構建及其用于混合轉化D-阿拉伯糖醇生產木糖醇的方法。

背景技術

木糖醇是一種五碳糖，其化學名稱為?1,2,3,4,5—戊醇，分子式為C₅H₁₂O₅，是一種白色結晶或結晶性粉末，它的溶解度、溶液密度和折光系數等理化性質與蔗糖基本相同，可以作為蔗糖的替代品。木糖醇是一種具有較高營養價值的天然甜味物質，同時也是一種低能量甜味劑。木糖醇是人體糖類代謝的中間體，食用后不消耗胰島素，并且木糖醇具有特殊的防齲功能，可作糖尿病人的營養劑、治療劑及兒童防齲食品，同時木糖醇還具有降低血糖濃度、促進鈣吸收等多種功能。

目前，木糖醇工業生產主要采用化學酸化催化加氫法和利用微生物直接發酵半纖維素水解液生產木糖醇，這兩種方法的原料多來源于富含多縮戊糖的玉米芯、甘蔗渣等農副產品，這些原料首先經過高溫水解后成為含大量木糖的水解液，因此存在酸堿消耗高、環境污染嚴重、工藝復雜等問題。全生物法制備木糖醇的研究已經引起了全球的關注，但是在自然界中還沒有發現直接發酵葡萄糖生產木糖醇的微生物。1969年，Onishi和Suzuki首先報道了通過三步發酵將葡萄糖轉化為木糖醇，首先利用?Osmophilic?yeast將葡萄糖轉化為D-阿拉伯糖醇，再利用Acetic?acid?bacteria將生成的D-阿拉伯糖醇氧化成D-木酮糖，之后D-木酮糖被一種酵母還原為木糖醇，但是其轉化率非常低，后續發酵過程復雜。

我們利用氧化葡糖桿菌(Gluconobacter?oxydans)將D-阿拉伯糖醇氧化還原為木糖醇，氧化葡糖桿菌購自中國微生物菌種保藏中心，編號：CGMCC1.110，該菌同時具有D-阿拉伯糖醇脫氫酶（AraDH）和木糖醇脫氫酶（XDH）活力，能夠將D-阿拉伯糖醇大部分氧化為木酮糖，而XDH的活力相對較低，木糖醇的生成量就遠遠小于D-木酮糖的量，如果以木糖醇為目的產物，如何提高XDH的活力成為研究的關鍵。

發明內容

本發明的目的是提供一株具有高木糖醇脫氫酶活力的基因工程菌大腸桿菌BL-xdh06??Escherichia?coli?BL-xdh06，已于2012年6月7日保藏于中國武漢的武漢大學的中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCC?NO.?M?2012207。

本發明的另一個目的是提供一種具有高轉化率的混合靜止轉化D-阿拉伯糖醇生產木糖醇的方法。利用氧化葡糖桿菌混合靜止轉化D-阿拉伯糖醇生產木糖醇的方法，按照下述步驟進行：

（1）挑取氧化葡糖桿菌(Gluconobacter?oxydans)斜面菌落于種子液培養基，28-37℃、100-260?rpm振蕩培養8-20h。

（2）將種子液以體積比1-10?%的接種量接種到擴大培養基，28-37℃、100-260?rpm振蕩培養48-96h。

（3）將（2）中的發酵液6000-12000?rpm，4℃離心5-20?min，收集菌泥，用0.1?mol/L?pH?6.8的磷酸鉀緩沖液洗滌，離心后用適量的細胞轉化液重懸菌體；????

（4）轉化液轉化溫度為28-37?℃，100-260rpm振蕩轉化24-60h，4h取樣，4h取樣，轉化液中得到木糖醇。

本發明的另一個目的是提供一種具有高轉化率的混合靜止轉化D-阿拉伯糖醇生產木糖醇的方法。利用構建的基因工程菌和氧化葡糖桿菌混合靜止轉化D-阿拉伯糖醇生產木糖醇，D-阿拉伯糖醇的轉化率由29?%提高到91.6?%。

利用上述構建的基因工程菌和氧化葡糖桿菌混合靜止轉化D-阿拉伯糖醇生產木糖醇的方法，按照下述步驟進行：

（1）挑取氧化葡糖桿菌(Gluconobacter?oxydans)斜面菌落于種子液培養基，28-37℃、100-260?rpm振蕩培養8-20h。

（2）將種子液以體積比1-10?%的接種量接種到擴大培養基，28-37℃、100-260?rpm振蕩培養48-96h。

（3）將（2）中的發酵液6000-12000?rpm，4℃離心5-20?min，收集菌泥，用0.1?mol/L?pH?6.8的磷酸鉀緩沖液洗滌，離心后用適量的細胞轉化液重懸菌體；????