[發明專利]一種木糖醇基因工程菌及其混合轉化生產木糖醇的方法有效
| 申請號： | 201210209060.5 | 申請日： | 2012-06-25 |
| 公開（公告）號： | CN102936576A | 公開（公告）日： | 2013-02-20 |
| 發明（設計）人： | 齊向輝;郭齊;王飛;鄧文穎;王亮;孫文敬;陳華友;蒙健宗;張云光 | 申請（專利權）人： | 江蘇大學 |
| 主分類號： | C12N1/21 | 分類號： | C12N1/21;C12P39/00;C12P19/02;C12R1/19;C12R1/01 |
| 代理公司： | 南京經緯專利商標代理有限公司 32200 | 代理人： | 樓高潮 |
| 地址： | 212013 江*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 木糖醇 基因工程 及其 混合 轉化 生產 方法 | ||
1.一種木糖醇基因工程菌大腸桿菌BL-xdh06??Escherichia?coli?BL-xdh06，保藏編號為CCTCC?NO.?M?2012207。
2.利用權利要求1所述的木糖醇基因工程菌和氧化葡糖桿菌混合靜止轉化D-阿拉伯糖醇生產木糖醇的方法，其特征在于按照下述步驟進行：
（1）挑取氧化葡糖桿菌(Gluconobacter?oxydans)斜面菌落于種子液培養基，28-37℃、100-260?rpm振蕩培養8-20h；
（2）將種子液以體積比1-10?%的接種量接種到擴大培養基，28-37℃、100-260?rpm振蕩培養48-96h；
（3）將（2）中的發酵液6000-12000?rpm，4℃離心5-20?min，收集菌泥，用0.1?mol/L?pH?6.8的磷酸鉀緩沖液洗滌，離心后用適量的細胞轉化液重懸菌體；?
（4）將基因工程菌E.coli?BL21-xdh06接種于LB-氨芐青霉素培養基中，37?℃振蕩培養過夜，次日以1-10?%的接種量將種子液轉接至新鮮LB-Amp培養基中，37?℃培養至菌體光密度值約為0.6-0.8時，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度0.5-1.2mmol/L進行誘導表達5-15h；
取一定體積工程菌液6000-12000?rpm，4℃離心5-20?min，收集菌泥，用0.1?mol/L?pH?6.8的磷酸鉀緩沖液洗滌，菌體待用；
（5）將（3）和（4）離心得到得菌體用適量的細胞轉化液重懸菌體；
（6）轉化液轉化溫度為28-37?℃，100-260rpm振蕩轉化24-60h，?4h取樣，轉化液中得到木糖醇。
3.利用氧化葡糖桿菌靜止轉化D-阿拉伯糖醇生產木糖醇的方法，其特征在于按照下述步驟進行：
（1）挑取氧化葡糖桿菌(Gluconobacter?oxydans)斜面菌落于種子液培養基，28-37℃、100-260?rpm振蕩培養8-20h；
（2）將種子液以體積比1-10?%的接種量接種到擴大培養基，28-37℃、100-260?rpm振蕩培養48-96h；
（3）將（2）中的發酵液6000-12000?rpm，4℃離心5-20?min，收集菌泥，用0.1?mol/L?pH?6.8的磷酸鉀緩沖液洗滌，離心后用適量的細胞轉化液重懸菌體；????
（4）轉化液轉化溫度為28-37?℃，100-260rpm振蕩轉化24-60h，間隔4h取樣，4h取樣，轉化液中得到木糖醇。
4.根據權利要求2所述的木糖醇基因工程菌和氧化葡糖桿菌混合靜止轉化D-阿拉伯糖醇生產木糖醇的方法，其特征在于其中步驟（1）所述的種子液培養基組成如下：葡萄糖20-40.0?g/L，胰蛋白胨?1-10.0?g/L，酵母膏2-20.0?g/L；氧化葡糖桿菌斜面培養基：葡萄糖20-40.0?g/L，胰蛋白胨?1-10.0?g/L，酵母膏2-20.0?g/L，瓊脂10-20?g/L，其余為水；
其中步驟（2）所述的擴大培養基組成如下：葡萄糖?20-40.0?g/L，酵母膏?2-20.0?g/L，胰蛋白胨?1-10.0?g/L，D-阿拉伯糖醇?5-20.0?g/L，碳酸鈣?10-20.0?g/L，其余為水；
其中步驟（3）所述的細胞轉化液組成如下：D-阿拉伯糖醇20-40.0?g/L，碳酸鈣10-30.0?g/L，乙醇3-8%（V/V），其余為水；
其中步驟（4）所述的LB-Amp培養基組成如下：胰化蛋白胨?10g/L，酵母提取物?5g/L，NaCl?10g/L，氨芐青霉素終濃度50μg/L，其余為水；
其中步驟（5）所述的細胞轉化液包組成如下：D-阿拉伯糖醇20-40.0?g/L，碳酸鈣10-30.0?g/L，乙醇3-8%（V/V），其余為水。
5.根據權利要求3所述的利用氧化葡糖桿菌混合靜止轉化D-阿拉伯糖醇生產木糖醇的方法，其特征在于其中步驟（1）所述的種子液培養基組成如下：葡萄糖20-40.0?g/L，胰蛋白胨?1-10.0?g/L，酵母膏2-20.0?g/L；氧化葡糖桿菌斜面培養基：葡萄糖20-40.0?g/L，胰蛋白胨?1-10.0?g/L，酵母膏2-20.0?g/L，瓊脂10-20?g/L，其余為水；
其中步驟（2）所述的擴大培養基組成如下：葡萄糖?20-40.0?g/L，酵母膏?2-20.0?g/L，胰蛋白胨?1-10.0?g/L，D-阿拉伯糖醇?5-20.0?g/L，碳酸鈣?10-20.0?g/L，其余為水；
其中步驟（3）所述的細胞轉化液組成如下：D-阿拉伯糖醇20-40.0?g/L，碳酸鈣10-30.0?g/L，乙醇3-8%（V/V），其余為水。
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