[發明專利]鋅指蛋白的快速篩選方法

有效

• 申請號: 201210207952.1
• 申請日: 2012-06-21
• 公開（公告）號: CN102850429A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 夏海濱;張偉鋒
• 申請（專利權）人: 陜西師范大學
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C12N15/63;C12Q1/66;C12Q1/34;G01N21/64
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責任公司 61201
• 代理人: 申忠才

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于鋅指蛋白的快速篩選方法。

技術背景

鋅指蛋白最初于1983年由諾貝爾獎獲得者Klug和同事在非洲爪蟾卵母細胞的轉錄因子TFIIIA中被發現，是迄今在真核生物基因組中分布最廣的一類蛋白，人類基因組中有近1％的序列編碼含有鋅指結構的蛋白,由于該類蛋白形狀類似于一根手指,因此而得名。自從發現非洲爪蟾轉錄因子TFIII,許多科研工作者展開了一系列的研究,揭示了人工鋅指蛋白的廣闊應用前景。根據鋅指蛋白保守結構域的差異，可以將鋅指蛋白分為C2H2型（Krüppel相關型）、C4型和C6型等3個類群。C2H2鋅指是真核細胞中最常見的DNA結合模體。由于C2H2鋅指域靶位點特異性與結構和功能的模塊性構成,使得C2H2鋅指域對構建特定的DNA結合蛋白十分有用。2005年4月23日,Cys2His2鋅指蛋白作為人類基因治療的革命性的工具這一消息被刊登上了泰晤士報。目前鋅指蛋白已經被成功地應用與構建靶向特定基因的人工轉錄因子、靶向特定基因的鋅指核酸酶（可使基因打靶的效率提高10³-10⁵，該技術在2010年被科學家雜志評為十大科技進展），對該領域產生了深遠的影響。

Pavletich等(1991)的Zif268-DNA晶體復合物X射線衍射分析表明：鋅指單元的α螺旋伸入DNA大溝中,通過其外側的氨基酸殘基來識別DNA雙螺旋大溝中相鄰的3～4bp序列,并通過氫鍵與相應的堿基特異結合。而且與鋅指單元的靶位點特異性相關的主要是α螺旋的第-1，1，2，3，6位殘基。因此可以通過控制鋅指單元的數量可以識別特定長度的DNA序列的鋅指蛋白，正是由于鋅指蛋白這種特殊的結構使得能夠人工篩選針對任何特定DNA序列的鋅指蛋白（理論上）。目前研究人員已經開發出的鋅指蛋白的篩選方法總的來說可以分為兩類：一類是利用已經單獨篩選好的鋅指單元進行隨機的組合，產生鋅指蛋白；另一類是考慮到鋅指單元在結合時受到兩側的鋅指單元的影響，在保持兩個鋅指單元不動的情況下進行第三個鋅指的篩選。這些方法仍然存在以下缺點：

1、這些方法都是在細菌或是酵母中進行，因此鋅指與DNA的結合并不一定反應在哺乳動物細胞中的實際結合能力。

2、這些篩選方法不夠敏感，對于結合能力弱的鋅指蛋白容易被或略。

3、這些篩選方法成功率很低，工作量很大，一般實驗室難以實施。

發明內容

本發明所要解決的一個技術問題在于克服上述鋅指蛋白的篩選方法的缺點，提供一種簡單、高效的鋅指蛋白的快速篩選方法。

解決上述技術問題所采用的技術方案是由下述步驟組成：

1、構建小型鋅指蛋白庫

通過在線鋅指蛋白預測軟件預測鋅指蛋白靶序列并組裝鋅指蛋白，選擇1-50個鋅指蛋白組成小型鋅指蛋白庫。

2、構建嵌合型轉錄因子和鋅指蛋白檢測載體

由N端的鋅指蛋白和C端的轉錄激活結構域形成融合蛋白，在鋅指蛋白的5＇端插入核定位信號，組裝成嵌合型轉錄因子，由鋅指蛋白靶序列和下游的啟動子核心元件組成嵌合型啟動子，在嵌合型啟動子的下游插入報告基因組成鋅指蛋白檢測載體。

3、在哺乳動物細胞中篩選鋅指蛋白

將嵌合型轉錄因子和鋅指蛋白檢測載體共轉染到哺乳動物細胞內作為實驗組，將鋅指蛋白檢測載體單獨轉染到哺乳動物細胞內作為對照組，實驗組的報告基因表達強度高于或等于對照組5倍的是合格的鋅指蛋白。

本發明的鋅指蛋白是由三個鋅指單元組裝而成，其組裝過程是：以一條合成的模板鋅指蛋白的DNA序列為模板，通過聚合酶鏈式反應方法分別獲得三個鋅指單元，通過鋅指單元間的重疊聚合酶鏈式反應擴增獲得鋅指蛋白,模板鋅指蛋白的DNA序列為：

CCCCACGAGAGACCTTTCCAGTGCAGGATCTGTATGCGGAACTTCAGCCGCCAACAGAAGCTGGACACCCACACAAGGACCCATACTGGCGAAAAGCCCTTTCAATGTCGGATTTGCATGCGCAACTTTTCCCTCAGCCAGACACTGAAGAGGCACCTCCGGACACACACCGGAGAGAAACCATTCCAGTGTAGAATCTGCATGAGGAATTTCTCTCGCATGGACCACCTGGCCGGCCATCTGAGAACCCAT。

本發明的轉錄激活結構域是轉錄因子p65或VP16的轉錄激活結構域。