[發(fā)明專利]鋅指蛋白的快速篩選方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210207952.1
• 申請日: 2012-06-21
• 公開（公告）號: CN102850429A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏海濱;張偉鋒
• 申請（專利權(quán)）人: 陜西師范大學(xué)
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C12N15/63;C12Q1/66;C12Q1/34;G01N21/64
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責(zé)任公司 61201
• 代理人: 申忠才

1.一種鋅指蛋白的快速篩選方法，其特征在于它是由下述步驟組成：

（1）構(gòu)建小型鋅指蛋白庫

通過在線鋅指蛋白預(yù)測軟件預(yù)測鋅指蛋白靶序列并組裝鋅指蛋白，選擇1-50個鋅指蛋白組成小型鋅指蛋白庫；

（2）構(gòu)建嵌合型轉(zhuǎn)錄因子和鋅指蛋白檢測載體

由N端的鋅指蛋白和C端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域形成融合蛋白，在鋅指蛋白的5＇端插入核定位信號，組裝成嵌合型轉(zhuǎn)錄因子，由鋅指蛋白靶序列和下游的啟動子核心元件組成嵌合型啟動子，在嵌合型啟動子的下游插入報告基因組成鋅指蛋白檢測載體；

（3）在哺乳動物細(xì)胞中篩選鋅指蛋白

將嵌合型轉(zhuǎn)錄因子和鋅指蛋白檢測載體共轉(zhuǎn)染到哺乳動物細(xì)胞內(nèi)作為實(shí)驗(yàn)組，將鋅指蛋白檢測載體單獨(dú)轉(zhuǎn)染到哺乳動物細(xì)胞內(nèi)作為對照組，實(shí)驗(yàn)組的報告基因表達(dá)強(qiáng)度高于或等于對照組5倍的是合格的鋅指蛋白。

2.按照權(quán)利要求1所表述的鋅指蛋白的快速篩選方法，其特征在于所述的鋅指蛋白是由三個鋅指單元組裝而成，其組裝過程是：以一條合成的模板鋅指蛋白的DNA序列為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法分別獲得三個鋅指單元，通過鋅指單元間的重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增獲得鋅指蛋白,模板鋅指蛋白的DNA序列為：

CCCCACGAGAGACCTTTCCAGTGCAGGATCTGTATGCGGAACTTCAGCCGCCAACAGAAGCTGGACACCCACACAAGGACCCATACTGGCGAAAAGCCCTTTCAATGTCGGATTTGCATGCGCAACTTTTCCCTCAGCCAGACACTGAAGAGGCACCTCCGGACACACACCGGAGAGAAACCATTCCAGTGTAGAATCTGCATGAGGAATTTCTCTCGCATGGACCACCTGGCCGGCCATCTGAGAACCCAT。

3.按照權(quán)利要求1所表述的鋅指蛋白的快速篩選方法，其特征在于:所述的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域是轉(zhuǎn)錄因子p65或VP16的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。

4.按照權(quán)利要求1所表述的鋅指蛋白的快速篩選方法，其特征在于：所述的嵌合型轉(zhuǎn)錄因子在核定位信號的5＇端、核定位信號和鋅指蛋白間、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的3＇端之中的任意一個位置插入檢測標(biāo)簽，檢測標(biāo)簽從Flag、HA、His、myc的任意一種中選擇。

5.按照權(quán)利要求1所表述的鋅指蛋白的快速篩選方法，其特征在于：所述的鋅指蛋白靶序列包含2-12次重復(fù)。

6.按照權(quán)利要求1所表述的鋅指蛋白的快速篩選方法，其特征在于：所述的啟動子核心元件是miniCMV或TAL?minipromoter；

miniCMV的DNA序列是：

GTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGA；

TAL?minipromoter的DNA序列是：

GCCGCCCCGACTGCATCTGCGTGTTCGAATTCGCCAATGACAAGACGCTGGGCGGGGTTTGTGTCATCATAGAACTAAAGACATGCAAATATATTTCTTCCGGGGACACCGCCAGCAAACGCGAGCAACGGGCCACGGGGATGAAGCAG。

7.按照權(quán)利要求1所表述的鋅指蛋白的快速篩選方法，其特征在于：所述的報告基因是熒光素酶、綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、β-半乳糖苷酶中的任意一種。

8.按照權(quán)利要求1或9所述的鋅指蛋白的快速篩選方法，其特征在于：所述的哺乳動物細(xì)胞是HEK293、293T、Hela、U87、NIH3T3中的任意一種。