[發明專利]一種檢測去氫甲睪酮的酶聯免疫試劑盒及使用方法

無效

• 申請號: 201210206694.5
• 申請日: 2012-06-21
• 公開（公告）號: CN102707073A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 董英;姚萍
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

技術領域

????本發明涉及酶聯免疫和獸藥殘留檢測技術領域，具體而言，本發明涉及一種用于檢測去氫甲睪酮的酶聯免疫試劑盒及使用方法。

技術背景

去氫甲睪酮（1-dehydro-17-methyltestosterone,?DMT），又名大力補、美雄酮，分子式：C₂₀H₂₈O₂，分子量300.44。DMT目前在醫學臨床上普遍用于再生障礙性貧血、男性發育遲緩、燒傷處理、手術后慢性消耗性疾病、老年骨質疏松和腫瘤惡液汁病等。但DMT屬于蛋白質同化激素類，長期或大量服用會對人體有很多副作用。如導致肝功能障礙，生殖功能紊亂，增加患心血管疾病的風險等。DMT還具有促進動物體內營養物質沉積和改善生產性能的作用，在畜牧業上常被用作動物飼料添加劑，以促進動物生長，提高產量。但蛋白同化激素作為飼料添加劑應用于畜牧生產時，會在動物體內殘留，當人們長期食用含有該藥物殘留的動物性食品時，同樣會造成人的生殖系統障礙、發育異常及某些癌癥如乳房癌、睪丸癌等，嚴重危害人類健康。

目前，DMT常用的檢測方法多為儀器檢測方法，如高效液相色譜（HPLC）、液質聯用（LC-MS）和氣質聯用（GC-MS）等。這些儀器檢測方法需要復雜的儀器，且過程繁瑣，不適應現場大量樣品的篩查。基于抗原抗體免疫反應的免疫學檢測技術為小分子殘留物的分析檢測提供了一個新的途徑。

因為DMT是小分子化合物，本身沒有免疫原性，必須將其與大分子載體蛋白偶聯得到具有免疫原性的人工抗原。DMT人工抗原和特異性抗體以及在此基礎上建立免疫分析方法尚未見報道。

發明內容???

本發明的目的在于提供一種快速檢測DMT的酶聯免疫試劑盒及使用方法。

本發明提供了一種快速檢測DMT的酶聯免疫試劑盒，該試劑盒包括：DMT特異性抗體、DMT-載體蛋白偶聯物和酶標二抗，三者體積組成比例為1:2:2。

其中DMT特異性抗體為鼠抗DMT的單克隆抗體，可用DMT與載體蛋白偶聯物作為免疫原通過免疫BALB/c小鼠制得。

所述載體蛋白為牛血清白蛋白（BSA），所述DMT與載體蛋白的偶聯物可通過將DMT和載體蛋白用活化酯法進行偶聯得到。

本發明所述的一種快速檢測DMT的酶聯免疫試劑盒，還進一步包括用于固定DMT與載體蛋白偶聯物的載體物質很多，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。載體的形式是微量反應板凹孔。

為方便現場檢測和大量樣本篩查，所述的試劑盒還可以進一步包括DMT標準溶液、底物顯色劑、洗滌液、終止液和濃縮樣品稀釋液。

所述的洗滌液為0.5%吐溫-20磷酸鹽緩沖液。

所述的顯色劑由顯色劑A液和顯色劑B液組成（例如，體積比為1:19），顯色劑A液為過氧化氫，顯色劑B液為四甲基聯苯胺。

所述的濃縮樣品稀釋液為0.01M，PH7.4的磷酸鹽緩沖液。

另一方面，本發明還提供了利用上述試劑盒檢測樣品中DMT含量的方法，按照下述步驟進行：

（1）樣品前處理：取10?g（其中肉5?g，精確至0.01?g）絞碎的豬肉的空白樣品（肉與水同等重量攪勻）置于50?mL離心管中；添加一定量的DMT標準液后加入叔丁基甲醚20?mL，渦旋混勻器混勻1?min，置于超聲波發生器中超聲波提取10?min，取出8000?r/min離心5?min，有機相轉移至另一支50?mL離心管中；下層再用20?mL叔丁基甲醚分2次提取，有機相轉移至對應離心管中；40?℃旋轉蒸發，加2?%甲醇-PBS定容至10?mL；進行ELISA測定。

（2）用試劑盒進行檢測，向包被有去氫甲睪酮抗原的酶標板孔中加入標準品或樣品溶液，再加入去氫甲睪酮單克隆抗體，孵育后洗滌排干，加入酶標記二抗，孵育后洗滌排干，顯色、終止，用酶標儀測定吸光度值。

（3）分析檢測結果。

本發明試劑盒的檢測原理為：

將DMT抗原吸附于固相載體上，加入樣本或DMT標準品溶液并加入DMT抗體工作液，待測樣品中DMT和固相載體上包被的DMT抗原競爭DMT抗體，再加入酶標記抗抗體進行酶活性的放大作用，顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中DMT的量呈負相關，與標準曲線比較即可得出DMT濃度范圍。

有益效果：

本發明檢測DMT的試劑盒主要采用間接競爭酶聯免疫法定性或定量樣品中DMT含量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批樣品。