[發(fā)明專利]利用雙向電泳技術(shù)獲得刺參性腺蛋白質(zhì)二維電泳圖譜的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210206058.2
• 申請日: 2012-06-21
• 公開（公告）號: CN102721730A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 田燚;常亞青;莫海波;湛垚垚
• 申請（專利權(quán)）人: 大連海洋大學(xué)
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447;G01N1/28
• 代理公司: 大連非凡專利事務(wù)所 21220
• 代理人: 曲寶威

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種獲得二維電泳圖譜的方法，特別是一種利用雙向電泳技術(shù)獲得刺參性腺蛋白質(zhì)二維電泳圖譜的方法。

背景技術(shù)

海參不但具有較高營養(yǎng)價值，同時還具有藥用價值，是被廣泛認同的具有特殊滋補與營養(yǎng)保健多重功效的海珍品。隨著人們對刺參需求量的增加，采捕強度逐漸增大，造成海參資源量急劇下降。同時，海參人工養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，海參種質(zhì)退化現(xiàn)象日趨嚴重，養(yǎng)殖病害日趨嚴重等一系列問題，嚴重制約著海參產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，開展海參的蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)研究，可以為海參的人工育苗繁殖及養(yǎng)殖技術(shù)研究工作奠定基礎(chǔ)，研究結(jié)果將有助于提高海參產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益和社會效益。

蛋白質(zhì)組學(xué)是功能基因組研究的一個重要平臺，其三大核心技術(shù)分別為雙向電泳技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)。雙向電泳是最早的蛋白質(zhì)組研究工具，到目前為止，也是最重要的研究工具之一。它以蛋白質(zhì)的等電點和分子量作為獨立參數(shù)，第一向電泳根據(jù)蛋白質(zhì)等電點的不同，對樣品進行等點聚集分離，然后在第二向根據(jù)分子量大小用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，最終可獲得分辨率很高的二維圖譜，為后續(xù)蛋白質(zhì)的鑒定提供良好的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)可以在一塊凝膠上分辨出1800多個蛋白質(zhì)點，能同時分析成百上千的基因表達產(chǎn)物。迄今為止，利用雙向電泳技術(shù)開展的蛋白質(zhì)組研究工作在生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有了一定的應(yīng)用。但目前在海洋水產(chǎn)方面的研究卻相對較少，只在泥蚶肌肉、大彈涂魚肝臟、鋸緣青蟹肌肉、蝦夷扇貝鰓、海兔肝臟、魚腥藻外膜蛋白、中華鹵蟲無節(jié)幼蟲總蛋白、鯉魚等品種開展了相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)的工作。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種好操作、易控制的利用雙向電泳技術(shù)獲得刺參性腺蛋白質(zhì)二維電泳圖譜的方法，為刺參性別決定機制及繁殖育種工作提供技術(shù)條件和平臺，進而提高刺參產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益和社會效益。

本發(fā)明的利用雙向電泳技術(shù)獲得刺參性腺蛋白質(zhì)二維電泳圖譜的方法，步驟如下：

a、刺參性腺總蛋白質(zhì)的制備

取刺參性腺并在液氮的低溫中將組織研磨成粉末，利用三氯醋酸丙酮法對粉末狀組織進行裂解處理，得到刺參性腺可溶性蛋白質(zhì)；

b、對上述蛋白質(zhì)含量測定

采用標準蛋白質(zhì)定量試劑盒，用酶標儀測定吸光度值，其中包括標準管、測定管和空白管的各個吸光度值，然后用公式計算蛋白質(zhì)含量；所述的公式為：

蛋白含量?g/L?=??????????????????????????????????????????????????×

測定分裝后在–80℃的條件下保存?zhèn)溆茫?/p>

c、雙向電泳

等電聚焦：取上述備用的蛋白質(zhì)在冰上融化按雌、雄分別設(shè)置上樣量，配置等電聚焦膠條后置于等電聚焦儀進行聚焦電泳；

IPG膠條的平衡：將等電聚焦的膠條置于平衡液中進行平衡；

SDS-PAGE電泳：分別采用6%的濃縮膠和12%的分離膠進行不連續(xù)SDS-PAGE垂直電泳，平衡后將膠條轉(zhuǎn)移到SDS凝膠上，調(diào)整膠條位置使其與SDS濃縮膠充分接觸，并排出其間氣泡，開始電泳；

d、染色

將凝膠置于染色容器內(nèi)，采用硝酸銀染色法對凝膠進行染色；

e、拍照得二維電泳圖譜。

本發(fā)明的利用雙向電泳技術(shù)獲得刺參性腺蛋白質(zhì)二維電泳圖譜的方法，其中所述的利用三氯醋酸丙酮法對粉末狀組織進行裂解處理，得到刺參性腺可溶性蛋白質(zhì)步驟如下：

將所述的粉末懸浮于裂解液中，所述的裂解液為丙酮溶液，其中含DTT和?三氯醋酸，DTT占總體積的0.2%，三氯醋酸占總體積的10%；

在–20℃的條件下沉淀4h；然后在4℃的條件下離心處理5min，?轉(zhuǎn)速為12000rmp/min；?沉淀后重懸于含DTT的預(yù)冷丙酮中，其中DTT占液體總體積的0.2%；

-20℃放置1h；

在4℃的條件下離心處理30min，轉(zhuǎn)速為?12000rmp/min；

在通風(fēng)櫥中讓丙酮充分揮發(fā)，得到干燥的沉淀；

在裂解液中重新溶解沉淀30min，每50-100mg組織需要1ml裂解液；

在4℃條件下離心處理30min,?轉(zhuǎn)速為12000rmp/min；?

取上清即為刺參性腺可溶性蛋白。

本發(fā)明的利用雙向電泳技術(shù)獲得刺參性腺蛋白質(zhì)二維電泳圖譜的方法，所述的等電聚焦電泳參數(shù)設(shè)置為：電壓1000v，電流7mA，功率50w，時間3h。