[發明專利]利用雙向電泳技術獲得刺參性腺蛋白質二維電泳圖譜的方法

無效

• 申請號: 201210206058.2
• 申請日: 2012-06-21
• 公開（公告）號: CN102721730A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 田燚;常亞青;莫海波;湛垚垚
• 申請（專利權）人: 大連海洋大學
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447;G01N1/28
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 曲寶威

1.一種利用雙向電泳技術獲得刺參性腺蛋白質二維電泳圖譜的方法，其特征在于步驟如下：

a、刺參性腺總蛋白質的制備

取刺參性腺并在液氮的低溫中將組織研磨成粉末，利用三氯醋酸丙酮法對粉末狀組織進行裂解處理，得到刺參性腺可溶性蛋白質；

b、對上述蛋白質含量測定

采用標準蛋白質定量試劑盒，用酶標儀測定吸光度值，其中包括標準管、測定管和空白管的各個吸光度值，然后用公式計算蛋白質含量；所述的公式為：

蛋白含量?g/L=??????????????????????????????????????????????????×

測定分裝后在–80℃的條件下保存備用；

c、雙向電泳

等電聚焦：取上述備用的蛋白質在冰上融化按雌、雄分別設置上樣量，配置等電聚焦膠條后置于等電聚焦儀進行聚焦電泳；

IPG膠條的平衡：將等電聚焦的膠條置于平衡液中進行平衡；

SDS-PAGE電泳：分別采用6%的濃縮膠和12%的分離膠進行不連續SDS-PAGE垂直電泳，平衡后將膠條轉移到SDS凝膠上，調整膠條位置使其與SDS濃縮膠充分接觸，并排出其間氣泡，開始電泳；

d、染色

將凝膠置于染色容器內，采用硝酸銀染色法對凝膠進行染色；

e、拍照得二維電泳圖譜。

2.根據權利要求1所述的利用雙向電泳技術獲得刺參性腺蛋白質二維電泳圖譜的方法，其特征在于：所述的利用三氯醋酸丙酮法對粉末狀組織進行裂解處理，得到刺參性腺可溶性蛋白質步驟如下：

將所述的粉末懸浮于裂解液中，所述的裂解液為丙酮溶液，其中含DTT和?三氯醋酸，DTT占總體積的0.2%，三氯醋酸占總體積的10%；

在–20℃的條件下沉淀4h；然后在4℃的條件下離心處理5min，?轉速為12000rmp/min；?沉淀后重懸于含DTT的預冷丙酮中，其中DTT占液體總體積的0.2%；

-20℃放置1h；

在4℃的條件下離心處理30min，轉速為?12000rmp/min；

在通風櫥中讓丙酮充分揮發，得到干燥的沉淀；

在裂解液中重新溶解沉淀30min，每50-100mg組織需要1ml裂解液；

在4℃條件下離心處理30min,?轉速為12000rmp/min；?

取上清即為刺參性腺可溶性蛋白。

3.根據權利要求2所述的利用雙向電泳技術獲得刺參性腺蛋白質二維電泳圖譜的方法，其特征在于：所述的等電聚焦電泳參數設置為：電壓1000v，電流7mA，功率50w，時間3h。

4.根據權利要求3所述的利用雙向電泳技術獲得刺參性腺蛋白質二維電泳圖譜的方法，其特征在于：所述的平衡液成份如下：β-巰基乙醇5ml、1M?且pH?6.8的Tris-HCl?6.25ml、20%SDS?11.5ml、甘油10ml、雙蒸水67.25ml；使用平衡液時加入溴酚藍，溴酚藍與平衡液的體積比為1:9；平衡時間為30?min。

5.根據權利要求4所述的利用雙向電泳技術獲得刺參性腺蛋白質二維電泳圖譜的方法，其特征在于：所述的SDS-PAGE電泳采用垂直電泳槽，利用DYY-10型電泳儀電泳，在上、下槽中加入l倍的電泳緩沖液，以20?mA／膠板恒流電泳，直到溴酚藍到達分離膠底部距膠邊緣約l?cm處停止電泳；SDS-PAGE電泳中電壓為200V，電流為80mA。