[發明專利]一種新型非核糖體肽合成酶基因及其腺苷酰化結構域的克隆和表達

無效

• 申請號: 201210205929.9
• 申請日: 2012-06-20
• 公開（公告）號: CN102719464A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 陸勇軍;周世寧;劉莉璇;黃雅莉;何磊
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/61
• 分類號: C12N15/61;C12N15/10;C12N9/90;C12N15/63;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;楊磊

1.一種新型非核糖體肽合成酶基因，其特征在于，所述非核糖體肽合成酶基因命名為NRPS114，所述基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO?1所示。

2.一種如權利要求1所述新型非核糖體肽合成酶基因的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：通過簡并引物序列篩選的方法，從南海深海沉積物大片段文庫中獲得7個陽性克隆子，挑選一個進行全長測序，然后運用生物信息學軟件對所得序列進行分析，即可獲得所述非核糖體肽合成酶基因。

3.一種由權利要求1所述基因編碼的非核糖體肽合成酶，其特征在于，所述非核糖體肽合成酶含有5個模塊，共16個結構域，起始模塊中含有3個結構域，分別為腺苷酰化結構域、甲基轉移酶結構域和酰基載體蛋白結構域；第二模塊、第三模塊和第五模塊均為常規模塊，均含有縮合結構域、腺苷酰化結構域和酰基載體蛋白結構域；第四模塊含有兩個縮合結構域、一個腺苷酰化結構域和一個酰基載體蛋白結構域；末端模塊即第五模塊不含硫酯酶結構域。

4.一種含有如權利要求1所述非核糖體肽合成酶基因的重組質粒pCC1FOS^TM?Fosmid-NRPS114。

5.一種重組質粒pET28a-A-2his，其特征在于，所述重組質粒pET28a-A-2his包括分別含有如權利要求3中所述的五個腺苷酰化結構域的重組質粒pET28a-A1-2his、pET28a-A2-2his、pET28a-A3-2his、pET28a-A4-2his、pET28a-A5-2his，所述五個重組質粒均采用以下方法制備所得：分別根據五個腺苷酰化結構域的序列設計引物，以權利要求4所述的重組質粒pCC1FOS^TMFosmid-NRPS114為模板，進行PCR擴增，PCR產物經凝膠電泳并回收產物1，凝膠回收產物1經限制性內切酶雙酶切并回收產物2，質粒pET28a經雙酶切后與回收產物2連接，獲得連接產物，即得五個重組質粒pET28a-A1-2his、pET28a-A2-2his、pET28a-A3-2his、pET28a-A4-2his和pET28a-A5-2his。

6.一種表達菌株，其特征在于，所述表達菌株包括分別含有如權利要求3中所述的五個腺苷酰化結構域基因的五個大腸桿菌BL21-pET28a-A1-2his、BL21-pET28a-A2-2his、BL21-pET28a-A3-2his、BL21-pET28a-A4-2his、BL21-pET28a-A5-2his，所述五個大腸桿菌均采用以下方法構建所得：采用化轉法，分別將權利要求5中所得的五個重組質粒pET28a-A1-2his、pET28a-A2-2hispET28a-A3-2his、pET28a-A4-2his、pET28a-A5-2his轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞中，將細菌懸浮液恢復培養并稀釋涂布于卡那霉素抗性平板上培養，挑取陽性轉化子，即得腺苷酰化結構域基因的表達菌株大腸桿菌BL21-pET28a-A1-2his、BL21-pET28a-A2-2his、BL21-pET28a-A3-2his、BL21-pET28a-A4-2his和BL21-pET28a-A5-2his。

7.一種腺苷酰化結構域的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）按照權利要求5所述內容構建重組質粒pET28a-A-2his；

（2）將步驟（1）中構建的重組質粒按照權利要求6所述內容構建腺苷酰化結構域基因表達載體大腸桿菌；

（3）目的蛋白腺苷酰化結構域的誘導表達：將步驟（2）中構建得到的大腸桿菌涂布于卡那霉素抗性平板上，37℃倒置培養過夜，挑取單克隆接種于含有100μg/mL卡那霉素的液體培養基，37℃振蕩培養過夜，按體積比1：50的比例轉接至新鮮的卡那霉素液體培養基，于37℃、200rpm培養至OD₆₀₀=0.5~0.6；加入0.1mmol/L?IPTG，16℃,140rpm誘導培養20h；培養后經鎳柱低壓蛋白層析親和純化，即得重組腺苷酰化結構域。