[發明專利]一種新型非核糖體肽合成酶基因及其腺苷?；Y構域的克隆和表達

無效

• 申請號: 201210205929.9
• 申請日: 2012-06-20
• 公開（公告）號: CN102719464A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 陸勇軍;周世寧;劉莉璇;黃雅莉;何磊
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/61
• 分類號: C12N15/61;C12N15/10;C12N9/90;C12N15/63;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;楊磊

技術領域

本發明涉及一種新型非核糖體肽合成酶基因及其包含的五個腺苷?；Y構域基因，尤其是一種來自南海深海沉積物微生物的新型非核糖體肽合成酶基因及其包含的五個腺苷?；Y構域基因。

背景技術

非核糖體肽類是一大類由細菌或真菌的非核糖體肽合成酶合成的，具有生物活性的天然產物，并且在生物體內具有較好的抗酶解和抗化學降解特性。它的結構非常復雜，種類繁多。應用于臨床上的非核糖體肽類非常多，常見的有抗生素（達托霉素）、抗腫瘤（博來霉素）、抗真菌藥物或免疫抑制劑（環孢霉素）等。隨著細菌耐藥性的頻頻出現，抗生素類藥物的儲備越來越不足，人類對新型抗生素的需求越來越迫切，因此尋找新型非核糖體肽合成酶基因具有十分重要的意義。

非核糖體肽類通常需要一系列后修飾過程。盡管其合成的模式和酶的催化方式都非常保守，但由于可利用的氨基酸底物非常豐富，非核糖體肽合成酶自身結構的多樣性，使它的種類遠遠超過以核糖體合成的肽類。

非核糖體肽合成酶基因的操作潛力十分巨大，運用組合生物學技術對模塊進行重排或者改造，有望得到預期的多肽或者新的藥物。達托霉素就是一種新開發的脂肽類抗生素，對革蘭氏陽性細菌具有很強的抑制作用。組合抗生素已經成為傳統藥物的競爭者。

發明內容

本發明的第一個目的在于提供一種能夠產生非核糖體肽類的非核糖體肽合成酶基因，為組合生物學提供研究材料，為新藥的研發提供更多的候選化合物。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：一種新型非核糖體肽合成酶基因，所述非核糖體肽合成酶基因命名為NRPS114，所述非核糖體肽合成酶基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO?1所示。

本發明的第二個目的在于提供一種所述新型非核糖體肽合成酶基因的制備方法，為實現此目的采取的技術方案為：一種如上所述新型非核糖體肽合成酶基因的制備方法，包括以下步驟：通過簡并引物序列篩選的方法，從南海深海沉積物大片段文庫中獲得7個陽性克隆子，挑選一個進行全長測序，然后運用生物信息學軟件對所得序列進行分析，即可獲得所述非核糖體肽合成酶基因。

所述新型非核糖體肽合成酶基因NRPS114通過序列篩選的方法從南海深海沉積物文庫中獲得，NRPS114為一個17202bp大小的完整非核糖體肽合成酶基因，利用BLAST在線比對其核苷酸序列進行同源性搜索分析表明，所述新型非核糖體肽合成酶基因NRPS114與已知基因相似性很低，僅為30%左右。

本發明的第三個目的在于提供一種由上述所述非核糖體肽合成酶基因編碼的非核糖體肽合成酶，所述非核糖體肽合成酶與已發現的同類蛋白的模板排列順序不同，它含有5個模塊，共16個結構域，起始模塊中含有3個結構域，分別為腺苷酰化結構域、甲基轉移酶結構域和酰基載體蛋白結構域；第二模塊、第三模塊和第五模塊均為常規模塊，均含有縮合結構域、腺苷?；Y構域和?；d體蛋白結構域；第四模塊含有兩個縮合結構域、一個腺苷?；Y構域和一個?；d體蛋白結構域；末端模塊即第五模塊不含硫酯酶結構域。

本發明的第四個目的在于提供一種含有如上所述新型非核糖體肽合成酶基因的重組質粒pCC1FOS^TM?Fosmid-NRPS114。所述重組質粒pCC1FOSTMFosmid-NRPS114保存于大腸埃希菌EPI300中。

本發明的第五個目的在于提供一種重組質粒pET28a-A-2his，所述重組質粒pET28a-A-2his包括重組質粒pET28a-A1-2his、pET28a-A2-2his、pET28a-A3-2hispET28a-A4-2his、pET28a-A5-2his，所述五個重組質粒分別含有如上所述的五個腺苷?；Y構域，所述五個重組質粒均采用以下方法制備所得：分別根據五個腺苷?；Y構域的序列設計引物，以權利要求4所述的重組質粒pCC1FOS^TMFosmid-NRPS114為模板，進行PCR擴增，PCR產物經凝膠電泳并回收產物1，凝膠回收產物1經限制性內切酶雙酶切并回收產物2，質粒pET28a經雙酶切后與回收產物2連接，獲得連接產物，即得五個重組質粒pET28a-A1-2his、pET28a-A2-2his、pET28a-A3-2his、pET28a-A4-2his和pET28a-A5-2his。