[發明專利]一種海水中四環素抗性基因的檢測方法

無效

• 申請號: 201210205120.6
• 申請日: 2012-06-20
• 公開（公告）號: CN102876772A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 任利華;孫國華;劉愛英;劉麗娟;姜向陽;宋秀凱;姜會超
• 申請（專利權）人: 山東省海洋水產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京世譽鑫誠專利代理事務所(普通合伙) 11368
• 代理人: 郭官厚

技術領域

本發明屬于水環境污染物的檢測技術領域，具體涉及一種海水中新型污染物-抗生素抗性基因tet的檢測方法。?

背景技術

醫療和養殖中抗生素的大量使用，使抗生素通過生活污水和養殖廢水途徑進入水環境，環境中生物或細菌因此產生耐藥性基因。耐藥基因的傳播導致耐藥性可能從非致病菌轉移到致病細菌，并進一步傳播、發展成生態層次上的耐藥性，而使沒有接觸到抗生素的個體也產生耐藥性。Pruden等人（2006）首先將抗生素抗性基因（AntibioticResistanceGenes,ARGs）作為一種新型“環境污染物”提出。由于ARGs在生物體內可能長久而持續地傳播，即使攜帶ARGs的細胞被殺滅或消亡，它釋放到環境中的DNA因受脫氧核糖核酸酶的保護而仍然存在，并最終可能轉移給其它細胞，因此，ARGs在環境中的持久性殘留、菌群間的遷移、轉化和傳播，比抗生素殘留本身對環境生態的危害更大。?

近海環境中城市污水和養殖用水的大量排入，使抗性基因容易擴散進入海水環境并傳播給海水環境中微生物，獲得了耐藥性的微生物可能通過接觸、食物等多種方式傳播進入人體，對人類健康和水生生態系統安全構成巨大威脅。但迄今為止，抗生素抗性基因作為一類新?型環境污染物在我國海洋生態環境監測中還尚未將引起足夠重視，有關海水環境中的抗生素抗性基因污染檢測方法極為薄弱。四環素類抗生素是一種被廣泛用于人和動物的的細菌性感染的抗生素，此外，還被大量用作促生長劑投喂給動物，因而四環素抗性基因（tet）是水體中抗生素抗性基因污染的一種重要種類，但是目前海水中四環素抗性基因（tet）檢測還無系統成熟的方法。為保護海洋生態系統和保障人類自身健康，建立海水中四環素抗性基因（tet）的檢測方法，對海洋環境新型污染物ARGs進行監測是十分必要的。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種海水中新型污染物-抗生素抗性基因tet的檢測方法，通過PCR方法來檢測，其特征在于通過以下步驟來實現:?

（1）海水樣品的采集及處理?

以中速定量濾紙（孔徑30～50μm）抽濾待測海水樣品1L，除去海水中較大顆粒雜質，所得濾液用0.22μm濾膜過濾，保留0.22μm孔徑濾膜作為待測樣品。?

（2）提取水樣中DNA?

濾膜剪碎，置于1.5ml離心管，加入SDS裂解液（5.5％SDS，0.125mg/ml蛋白酶K）60℃溫育2小時，以酚-氯仿-異戊醇溶液（25:24:1，v/v/v）抽提兩遍，二倍體積乙醇加十分之一體積醋酸鈉-20℃沉淀1小時，離心，TE溶解，-20℃保存備用。?

（3）PCR擴增區域與引物序列?

PCR擴增檢測選取決定四環素類抗藥機制的兩類主要蛋白-外輸泵蛋白和核糖體保護蛋白基因。引物tet-AF:GCGCTNTATGCGTTGATGCA和tet-AR:ACAGCCCGTCAGGAAATT擴增四環素抗性基因-外輸蛋白基因tet(A)的387bp序列；引物tet-MF:ACAGAAAGCTTATTATATAAC和tet-MR:TGGCGTGTCTATGATGTTCAC擴增四環素抗性基因-核糖體保護蛋白基因tet(M)的171bp序列。?

（4）PCR擴增體系與條件?

PCR反應體系為25μL的反應體系包含50ng的模板，0.2mMdNTP，正反向引物分別0.4μM，1UTaq酶，2.5μL10×buffer。反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃復性30s，72℃延伸30s，進行30個循環；4℃保溫。?

（5）結果檢測?

PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，tet(A)引物對和tet(M)引物對分別產生387bp和171bp清晰條帶，如圖1所示，四環素抗性基因得到陽性擴增，說明海水中具有抗四環素抗性基因污染。?

附圖說明

圖1為四環素抗性基因PCR產物電泳圖,M：分子量標準；1：tet(A)；2：tet(M)；N：陰性對照；?

圖2為四環素抗性基因tet(A)PCR電泳結果，M：分子量標準；S1-S5：水樣S1-S5；N：陰性對照；?

圖3為四環素抗性基因tet(M)PCR電泳結果，M：分子量標準；S1-S5：水樣S1-S5；N：陰性對照。?

序列表

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<110>??山東省海洋水產研究所

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