[發明專利]一種海水中四環素抗性基因的檢測方法

無效

• 申請號: 201210205120.6
• 申請日: 2012-06-20
• 公開（公告）號: CN102876772A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 任利華;孫國華;劉愛英;劉麗娟;姜向陽;宋秀凱;姜會超
• 申請（專利權）人: 山東省海洋水產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京世譽鑫誠專利代理事務所(普通合伙) 11368
• 代理人: 郭官厚

1.一種海水中四環素抗性基因tet的檢測方法，其特征在于，取1L待測海水樣品，兩次抽濾，采用SDS法提取水樣中DNA，采用PCR法對外輸泵蛋白tet(A)和核糖體保護蛋白基因tet(M)進行檢測，檢測得到387bp和171bp的擴增帶譜。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述兩次抽濾是以孔徑30～50μm的中速定量濾紙抽濾待測海水樣品1L，除去海水中較大顆粒雜質，所得濾液用0.22μm?濾膜過濾，保留0.22μm?孔徑濾膜作為待測樣品。

3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述采用SDS法提取水樣中DNA的方法為：濾膜剪碎，置于1.5ml離心管，加入SDS裂解液60℃溫育2小時，以酚-氯仿-異戊醇溶液抽提兩遍，二倍體積乙醇加十分之一體積醋酸鈉-20℃沉淀1小時，離心，TE溶解，-20℃?保存備用，其中SDS裂解液含有5.5％SDS(W/V)和0.125mg/ml蛋白酶K，酚-氯仿-異戊醇溶液中酚：氯仿：異戊醇的體積比為25:24:1。

4.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述采用PCR法對外輸泵蛋白tet(A)和核糖體保護蛋白基因tet(M)進行檢測時使用的引物為：

引物tet-AF:核苷酸序列為GCGCTNTATGCGTTGATGCA和引物tet-AR:?核苷酸序列為ACAGCCCGTCAGGAAATT擴增四環素抗性基因-外輸蛋白基因tet(A)的387bp序列；引物tet-MF:?核苷酸序列為ACAGAAAGCTTATTATATAAC和tet-MR:?核苷酸序列為TGGCGTGTCTATGATGTTCAC擴增四環素抗性基因-核糖體保護蛋白基因tet(M)的171bp序列。

5.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述PCR的反應體系為25μL的反應體系，具體包含50ng的模板，0.2mM?dNTP，正反向引物分別0.4μM，1U?Taq酶，2.5μL?10×buffer；反應條件為：94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃復性30s，72℃?延伸30s，進行30個循環，4℃保溫。