[發(fā)明專利]旋毛蟲與乳腺癌相關(guān)抗原基因TS498抗體制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210204915.5
• 申請(qǐng)日: 2012-06-20
• 公開（公告）號(hào): CN102719441A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張西臣;李建華;任保彥;宮鵬濤;楊舉;張國(guó)才;張楠;左紹志;李赫;陳玉江
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C07K16/18;A61K39/395;A61P35/00
• 代理公司: 吉林長(zhǎng)春新紀(jì)元專利代理有限責(zé)任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

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技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明提供了旋毛蟲與MCF-7乳腺癌相關(guān)抗原基因TS498蛋白抗體及其制備方法，本發(fā)明還提供了該蛋白抗體的醫(yī)用用途，屬于生物制藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

旋毛蟲是一種重要的人獸共患寄生蟲，在對(duì)其長(zhǎng)期研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲的感染具有增加宿主抵抗腫瘤的能力。有研究發(fā)現(xiàn)旋毛蟲活蟲、旋毛蟲致弱蟲、旋毛蟲全抗原、旋毛蟲可溶性抗原和旋毛蟲ES抗原等均具多重抗腫瘤作用。目前發(fā)現(xiàn)旋毛蟲與腫瘤相關(guān)抗原具有抗腫瘤作用，因而旋毛蟲與腫瘤相關(guān)抗原蛋白抗體也具有抗腫瘤作用。目前未見旋毛蟲與MCF-7乳腺癌相關(guān)抗原基因蛋白抗體抗腫瘤的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明提供了旋毛蟲與腫瘤細(xì)胞相關(guān)蛋白基因TS498，為一種新的蛋白基因物質(zhì)，其抗體具有抗腫瘤生物活性。

本發(fā)明還提供了該相關(guān)基因蛋白抗體的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了該蛋白抗體的醫(yī)用用途，用于制備治療腫瘤的藥物。

本發(fā)明公開的旋毛蟲與MCF-7乳腺癌細(xì)胞相關(guān)蛋白，其DNA序列如SEQ?No.1所示。

本發(fā)明相關(guān)蛋白抗體的制備方法如下：

分別制備旋毛蟲和MCF-7乳腺癌細(xì)胞的抗血清，然后分別利用間接ELISA方法確定腫瘤細(xì)胞抗原與旋毛蟲陽(yáng)性血清、旋毛蟲抗原與腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性血清間是否存在相關(guān)抗原；利用western?blotting?方法確定與旋毛蟲相關(guān)的MCF-7細(xì)胞抗原的分子量大小，并分離相關(guān)蛋白，制備相關(guān)蛋白的抗血清。然后利用制備的抗血清對(duì)旋毛蟲cDNA表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行篩選，得到與MCF-7相關(guān)的旋毛蟲蛋白基因。克隆并原核表達(dá)相關(guān)蛋白，純化復(fù)性其原核表達(dá)蛋白作為免疫原免疫小鼠，獲得相關(guān)基因蛋白的抗體。

本發(fā)明所述的旋毛蟲與MCF-7乳腺癌細(xì)胞相關(guān)蛋白制備方法，其特征在于引物序列為SEQ?No.2：

上游:??5'-CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT-3',

下游:??5'-ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGC-3'。

本發(fā)明所述的旋毛蟲與MCF-7乳腺癌細(xì)胞相關(guān)蛋白制備方法，利用含特定酶切位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增TS98基因，引物序列為SEQ?No.3：

上游：5’-TCCGAATTCATGCAGGGCTATCGCAGTCC-3’，

下游：5’-?GCACTCGAGTCATCTCTTCTGACCAGCCGG?3’。

本發(fā)明所述的旋毛蟲與MCF-7乳腺癌細(xì)胞相關(guān)蛋白在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的積極效果在于：

旋毛蟲與腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原蛋白抗體能對(duì)腫瘤產(chǎn)生強(qiáng)的抑制作用，同時(shí)旋毛蟲與腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原TS498基因蛋白抗體易于制備和工業(yè)化。

附圖說(shuō)明：

圖1、旋毛蟲高免血清和MCF-7乳腺癌細(xì)胞粗抗原的交叉反應(yīng)及其分子量；

圖2、TS498基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；

圖3、重組克隆質(zhì)粒pMD18T-TS498的雙酶切鑒定（EcoR?I/XhoI）；

圖4、重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-TS498的雙酶切鑒定（EcoR?I/XhoⅠ）；

圖5、TS498的原核表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE?和Western?blot分析。

具體實(shí)施方法：

實(shí)施例1

1.旋毛蟲與MCF-7乳腺癌細(xì)胞相關(guān)蛋白確定

首先制備旋毛蟲可溶性抗原和MCF-7乳腺癌細(xì)胞抗原并分別免疫家兔和BalB/C小鼠制備兩種抗原的陽(yáng)性血清。用MCF-7可溶性蛋白和旋毛蟲可溶性粗抗原作為包被抗原，用兔抗旋毛蟲高免血清和鼠抗MCF-7細(xì)胞高免血清作為被檢抗體，通過(guò)建立間接ELISA方法檢測(cè)旋毛蟲與MCF-7乳腺癌細(xì)胞間的交叉抗原情況。結(jié)果表明，旋毛蟲抗原與MCF-7乳腺癌細(xì)胞抗血清之間及旋毛蟲抗血清與MCF-7乳腺癌細(xì)胞蛋白間均存在一定的交叉免疫反應(yīng)，同時(shí)，兩種蛋白不與兔和小鼠的健康血清反應(yīng)。經(jīng)反復(fù)摸索，得到最佳的抗體效價(jià)分別為抗旋毛蟲高免血清為1:3200，抗MCF-7乳腺癌細(xì)胞高免血清為1:6400，同時(shí)兩種抗原都不與健康小鼠血清反應(yīng)。

2.?旋毛蟲與MCF-7乳腺癌細(xì)胞相關(guān)抗原蛋白的western?bloting分子量的檢測(cè)