[發(fā)明專利]檢測IBR病毒抗體的金標(biāo)免疫滲濾試劑盒及檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210204875.4
• 申請日: 2012-06-20
• 公開（公告）號: CN102692499A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王武軍;徐淑菲;孔繁德;白泉陽;唐泰山;高麗欽;劉正才;黃一帆;鄭騰;張?bào)w銀
• 申請（專利權(quán)）人: 福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/531
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測IBR病毒抗體的金標(biāo)免疫滲濾試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)

牛傳染性鼻氣管炎（Infectious?bovine?rhinotracheitis，IBR），是由牛皰疹病毒Ⅰ型引起的牛的一種接觸性傳染病，以高熱、呼吸困難、上呼吸道及氣管粘膜發(fā)炎以及生殖道感染、結(jié)膜炎等為主要特征。一般牛群臨床發(fā)病率約20%-30%，但血清反應(yīng)陽性率要高得多，由于本病有潛伏感染和機(jī)體長期排毒的性質(zhì)，抗體陽性牛實(shí)際上就是隱性帶毒者。IBRV具有典型的泛嗜性，能侵襲多種器官和組織，引起多種臨床癥狀，給養(yǎng)牛業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，是國際動物貿(mào)易中進(jìn)口種牛、牛精液時(shí)的重點(diǎn)檢疫對象和進(jìn)口國應(yīng)高度關(guān)注的動物疫病之一，我國農(nóng)業(yè)部將其列為二類動物疫病。

牛傳染性鼻氣管炎幾乎遍布世界各地，我國主要奶牛進(jìn)口國澳大利亞、新西蘭等國均有發(fā)生。該病于1955年在美國科羅拉多州的育肥菜牛被首次報(bào)道，我國于1980年從新西蘭進(jìn)口的奶牛體內(nèi)首次分離到IBRV，隨后的血清學(xué)調(diào)查證實(shí)我國多個(gè)省市的牛群中均有一定比例的IBR抗體陽性牛存在。近幾年從國外進(jìn)口奶牛中也不同程度的檢出抗體陽性牛和分離出該病毒。因此清除IBR抗體陽性牛，排除潛伏感染動物是控制IBR最好最簡單的方法，但關(guān)鍵問題是要率先建立一種檢測IBR陽性牛的方法。目前，國內(nèi)已有的針對牛傳染性鼻氣管炎檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，包括經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒，病毒核酸的PCR檢測、病毒抗體的血清中和試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。檢驗(yàn)過程繁瑣，病毒檢測需要5d-6d才能報(bào)告陽性結(jié)果，血清抗體檢測方法中最快速的ELISA方法也需要2h-4h。而且現(xiàn)行檢測IBR抗體的試劑多為從國外進(jìn)口的ELISA診斷試劑盒，價(jià)格昂貴推高了檢測成本，同時(shí)還需要酶標(biāo)儀等特定儀器、操作者的實(shí)驗(yàn)技能和一定的試驗(yàn)環(huán)境條件，難以在基層臨床中推廣。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述實(shí)際問題，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測IBR病毒抗體的金標(biāo)免疫滲濾試劑盒及檢測方法，本發(fā)明具有特異、敏感、快速可靠、效果直觀、結(jié)果容易判斷等優(yōu)點(diǎn)，且不需要特殊儀器設(shè)備，檢測樣品的檢測結(jié)果可以保存?zhèn)洳椤?/p>

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明首先提供了一種檢測IBR病毒抗體的金標(biāo)免疫滲濾試劑盒，所述試劑盒的組成包括：

a）牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原；

b）金標(biāo)記羊抗牛抗體；

c）洗滌液；

d）封閉液。

所述牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原的制備方法如下：采用無血清培養(yǎng)方法在牛腎傳代細(xì)胞上培養(yǎng)牛傳染性鼻氣管炎病毒，將牛傳染性鼻氣管炎病毒的培養(yǎng)液反復(fù)凍融3次，5000?r/min離心30?min，取上清液裝入透析袋中，置于0.01?mol/L?pH7.4?PBS?緩沖液中透析，直至培養(yǎng)液透明清亮為止，然后將透析液濃縮。

所述無血清培養(yǎng)方法采用不添加血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12?（1:1），培養(yǎng)條件為37℃、5％CO₂。

所述封閉液為含10g/L酪蛋白、0.5mL/L?吐溫-20（Tween-20）的0.01?mol/L?pH7.2的PBS溶液或含5g/L酪蛋白、0.5mL/L?Tween-20的0.01?mol/L?pH7.2的PBS溶液；所述洗滌液為含0.5ml/L?Tween-20的0.01mol/L?pH7.2的PBS緩沖液。

本發(fā)明還提供了一種利用所述金標(biāo)免疫滲濾試劑盒檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體的方法，先將牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜上，用封閉液封閉后加待測血清樣品，洗滌液洗滌，然后加金標(biāo)記羊抗牛抗體，洗滌液洗滌，觀察結(jié)果，若點(diǎn)樣處出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)即為陽性，若不出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)即為陰性。

在試劑盒內(nèi)硝酸纖維素膜上對稱位置點(diǎn)樣如下：一點(diǎn)為牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原1μL作為檢測點(diǎn)，另一點(diǎn)為葡萄球菌A蛋白1μL作為質(zhì)控點(diǎn)；室溫干燥后加入100μL封閉液；待封閉液干燥后，加入待檢血清50-100μL；滲入后加入洗滌液洗滌；加金標(biāo)記羊抗牛抗體100μL；滲入后加入洗滌液洗滌，洗去未結(jié)合的金標(biāo)記羊抗牛抗體；5?min-10min?內(nèi)若在硝酸纖維素膜上點(diǎn)樣處出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)即為陽性，若不出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)即為陰性，作為試驗(yàn)有效的標(biāo)志，質(zhì)控點(diǎn)應(yīng)出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，否則該膜無效，應(yīng)重新點(diǎn)制膜。

所述點(diǎn)樣時(shí)牛傳染性鼻氣管炎病毒抗原濃度為0.95?mg/mL－1.81mg/mL，葡萄球菌A蛋白濃度為1?g/?L。