[發明專利]一種重組工程介導的大腸桿菌基因組點突變的方法

有效

• 申請號: 201210203212.0
• 申請日: 2012-06-19
• 公開（公告）號: CN102703424A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 尚廣東;蔣伏歡;張飛飛;石牡丹
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/63
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體是涉及一種高效的運用重組工程手段實現大腸桿菌基因組點突變的方法。

背景技術

大腸桿菌是遺傳學研究的最為透徹的微生物菌株，廣泛用于生物學的基礎研究。大腸桿菌同時也是工業生產中最重要的微生物菌株之一，是合成生物學和代謝工程的首選菌株。大腸桿菌在生產藥物、精細化工產品以及具工業催化價值的酶等方面有著廣泛的用途。這些實際的功能均與基因組上的基因密切關聯，因此闡述這些基因的功能和改善這些基因的品質是發揮大腸桿菌功能的重要途徑。在諸多研究手段中，基因組的點突變（即基因位點的點突變）是關鍵的一種。

經典的大腸桿菌基因組點突變的方法有兩種。均首先是通過重疊－延伸聚合酶鏈式反應等方法將引入突變位點的基因克隆在載體上，突變位點兩側含有與基因組序列一致的同源片段（設為A和B)。第一種方法選擇的是含有溫度敏感型復制子的載體。大腸桿菌的生長溫度是37°C，溫度敏感型復制子只能在30°C時進行復制，在37°C時，含溫度敏感型復制子的質粒因為不能復制而失去。當含有突變位點的含溫度敏感型復制子的質粒轉化至大腸桿菌后，首先在30°C培養，通過抗性選擇得到質粒游離于基因組的菌株，隨后提高培養溫度至37°C或42°C，迫使質粒通過突變位點一側的同源片段（任為A或B)整合至基因組上，隨后在30°C之下進行培養，篩選失去抗性（即失去質粒的）菌株，此時菌株有兩種類型，一種類型是用于第一步整合的片段（A或B)再次用于發生同源重組，而得到回復至原株基因組的菌株；另外一種類型是第二個同源片段（第一次為A，則此時為B；第一次為B，則此時為A）發生同源重組，而得到目的位點發生突變的突變株。第二種方法選擇的是含有不能在常規大腸桿菌中復制的復制子（如需要Pir蛋白才能復制的R6K復制子）和含有負篩選標記的質粒。一種典型的負篩選標記是編碼6-果糖基轉移酶的sacB基因，含有此基因的菌株（在質粒上或基因組上）不能在含10%的蔗糖培養基中生存。將克隆有突變位點和同源片段的重組質粒轉化至大腸桿菌后，由于質粒不能復制，在抗性篩選之下，迫使突變位點一側的同源片段（任為A或B)整合至基因組上。隨后將菌株在負篩選的條件下進行培養，與第一種方法類似，如相同的同源片段再次發生同源重組，則得到原株基因型的菌株；如不同的同源片段方式重組，則得到目的位點發生突變的菌株。由此可見，這兩個經典的方法的不足是：1.因為所需的同源片段較長（一般需1kb），故需要步驟煩瑣和耗時長的基因克隆步驟；2.在最終菌株中發生突變的比例可能相差較大，即需要篩選較多的克隆才能得到正確的突變株。

隨著重組工程方法學的興起，直接合成含突變位點的寡核苷酸，將之轉化大腸桿菌后篩再選點突變的菌株成為可能。重組工程一般使用來源于lambda噬菌體的三個基因。其中exo基因編碼5'->3外切酶，其作用于雙鏈DNA而得到3'端突出的DNA分子；bet基因編碼3'突出端的單鏈結合蛋白，同時促進同源片段之間的同源重組；gam基因編碼抑制內源性核酸酶的Gam蛋白，使得轉化的DNA分子免受菌株本身的核酸酶所降解，這三個基因共同行使重組酶的活性。重組工程突出優點是可以催化短至36bp之間的同源片段（稱為同源臂）之間的同源重組而實現DNA的克隆和修飾。突變寡核苷酸的方法雖然簡便，但迄今報道的突變率往往很低，在1%左右甚至更少，這就需要篩選大量的克隆才能得到正確的突變株。因此突變寡核苷酸的方法目前只具有基礎研究意義，目前難以推廣應用。

發明內容

為克服上述不足，本發明申請提出了一種基于重組工程的大腸桿菌基因組的點突變方法。

本方法的基本原理是首先通過重組工程的手段在基因組上引入含突變位點（單個或數個堿基）、30bp同源片段、兩側為歸巢核酸酶I-SceI酶切位點的卡那霉素抗性基因，隨后誘導表達的I-SceI作用于整合在基因組上的I-SceI酶切位點，促使30bp同源片段之間發生同源重組而將一個30bp同源片段、兩個I-SceI酶切位點和卡那霉素抗性基因去除，最終得到不含有任何冗余序列的、發生點突變的大腸桿菌突變株。

本發明所采用的技術方案包括以下步驟：

（1）通過重疊-延伸聚合酶鏈式反應獲得一個DNA修飾片段，所述DNA修飾片段依次由下列結構組成：基因組上靶位點（即待突變位點）上游50bp序列一致的50bp同源臂、突變位點（即突變成功的位點）、與靶位點下游30bp序列一致的30bp同源片段、兩側為兩個歸巢核酸酶I-SceI酶切位點的卡那霉素抗性基因、與靶位點下游50bp序列一致的50bp同源臂；