[發(fā)明專利]一種重組工程介導的大腸桿菌基因組點突變的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210203212.0
• 申請日: 2012-06-19
• 公開（公告）號: CN102703424A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發(fā)明（設計）人: 尚廣東;蔣伏歡;張飛飛;石牡丹
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/63
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

1.一種基于重組工程的大腸桿菌基因組點突變的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）通過重疊－延伸聚合酶鏈式反應獲得一個DNA修飾片段，所述DNA修飾片段依次由下列結構組成：與基因組上位點待突變靶位點上游50bp序列一致的左端50bp同源臂、突變位點、與靶位點下游30bp序列一致的30bp同源片段、兩側為兩個歸巢核酸酶I-SceI酶切位點的卡那霉素抗性基因和與靶位點下游50bp序列一致的右端50bp同源臂所組成；

（2）將含重組酶基因和I-SceI基因的質(zhì)粒pLS134轉化至大腸桿菌MG1655中；所述的質(zhì)粒pLS134是將PCR擴增的tetR-ptetA-I-SceI基因盒片段以NsiI酶切后，克隆至pBAD322的NsiI位點，得到重組克隆pLS133；再將exo，bet和gam三個重組酶基因從lambda噬菌體DNA中PCR擴增后，以NcoI和XhoI酶切后，克隆至pLS133的NcoI和SaII位點，得到目的質(zhì)粒pLS134；

（3）將步驟（1）得到的DNA修飾片段電轉化至以終濃度為0.15%的L-阿拉伯糖誘導下表達Red重組酶基因的步驟（2）的大腸桿菌電轉化感受態(tài)細胞中，通過重組酶介導的同源臂和大腸桿菌基因組上相同序列之間的同源重組，將所述DNA修飾片段中，左右50bp同源臂之間的片段整合至大腸桿菌基因組，在卡那霉素抗性篩選之下，獲得整合有突變位點、30bp同源片段和兩側為I-SceI酶切位點的卡那霉素抗性基因的卡那霉素抗性突變株；

（4）將步驟（3）得到的菌株在含終濃度為20μg/ml熱處理的氯四環(huán)素的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，熱失活的氯四環(huán)素誘導I-SceI酶的表達，I-SceI酶作用于整合在基因組上的I-SceI酶切位點，基因組發(fā)生雙鏈斷裂，促使菌株利用自身的重組功能催化30bp同源片段與靶位點下游30bp之間發(fā)生同源重組，從而將30bp同源片段、兩個I-SceI酶切位點及卡那霉素抗性基因消除，最終獲得發(fā)生點突變的大腸桿菌突變株。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所待突變位點和突變位點是一個或多個堿基。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，首先通過一個聚合酶鏈式反應得到含左側50bp同源臂、突變位點、30bp同源片段、一個I-SceI酶切位點和5'端卡那霉素抗性基因的DNA片段，再通過另外一個PCR反應得到3'端卡那霉素抗性基因、一個I-SceI酶切位點和右側50bp同源臂的DNA片段，在5'端卡那霉素抗性基因和3'端卡那霉素抗性基因之間含21bp的重疊序列；隨后通過重疊－延伸聚合酶鏈式反應獲得兩側為50bp同源臂的含突變位點、30bp同源片段以及兩側為I-SceI酶切位點的卡那霉素抗性基因的融合DNA修飾片段。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，同源臂用于通過重組酶催化的同源重組將含突變位點的DNA修飾片段整合至大腸桿菌的基因組；右側的50bp同源臂為靶位點下游的50bp序列，此50bp序列的前30bp為同源片段；30bp同源片段用于同源重組以去除一段30bp序列、兩個I-SceI酶切位點及卡那霉素抗性基因的冗余序列，所得變株的基因組不含突變位點外任何序列。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，重組酶基因是來自于lambda噬菌體的exo，bet和gam基因，重組酶基因是克隆在受L-阿拉伯糖所誘導啟動子之下；I-SceI基因克隆在受熱處理的氯四環(huán)素誘導的啟動子之下。含重組酶基因和I-SceI基因的質(zhì)粒pLS134游離于大腸桿菌MG1655的基因組。