[發明專利]一種生產輔酶Q10工程菌的構建方法、工程菌及其應用

有效

• 申請號: 201210201673.4
• 申請日: 2012-06-15
• 公開（公告）號: CN103509729A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 于洪巍;石一軍;陸文強;王昌澤;張建新
• 申請（專利權）人: 浙江新和成股份有限公司;上虞新和成生物化工有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/09;C12P7/66;C12R1/01
• 代理公司: 杭州裕陽專利事務所(普通合伙) 33221
• 代理人: 應圣義

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種生產輔酶Q10工程菌的構建方法、工程菌及其應用。

背景技術

輔酶Q是生物體內廣泛存在的脂溶性醌類化合物,不同來源的輔酶Q其側鏈異戊烯單位的數目不同,人類和哺乳動物是10個異戊烯單位，故稱輔酶Q10。

輔酶Q10是生物細胞呼吸鏈中的重要遞氫體，是一種良好的生化藥物，近年來已廣泛應用于各類心臟病、糖尿病、癌癥、急慢性肝炎、帕金森癥等疾病的治療。此外，在治療壞血病、十二指腸潰瘍、壞死性牙周炎以及促進胰腺功能和分泌等方面也有顯著效果。最近，研究者發現CoQ10具有抗衰老作用，從而將其應用擴展到化妝品和保健品領域，使其在國內外的需求進一步擴大。

輔酶Q10的制備方法主要有三種，即動植物組織提取法、化學合成法和微生物發酵法。動植物組織提取法中動植物輔酶Q10含量低，而且各種化學成份復雜，并受原料和來源限制，因此產品成本高，價格昂貴，規模化生產受到了一定限制。化學合成法技術上比較成熟，主要是以來源較豐富的茄尼醇為原料合成的，但其產物為順反異構體的混合物，生物活性低，合成生物活性高的CoQ10尚未達到工業化生產的程度。微生物發酵法合成的輔酶Q10成本低、無光學異構體，生物學活性高，大規模生產應用效果好。

常用的微生物包括紅螺菌，土壤桿菌，類球紅細菌，根瘤菌等。其中類球紅細菌培養簡單，是輔酶Q10高效的生產菌之一。輔酶Q10分子結構由兩部分組成：醌環部分和異戊二烯側鏈部分。醌環骨架由分支酸途徑合成，前體是對羥基苯甲酸。側鏈由異戊二烯途徑合成，側鏈的長短決定了輔酶Q的種類的不同。在類球紅細菌中，異戊二烯焦磷酸異構體二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）與9分子異戊二烯焦磷酸（IPP）依次在牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶及聚十異戊二烯焦磷酸合酶的催化下生成聚十異戊二烯焦磷酸。十異戊二烯焦磷酸和對羥基苯甲酸縮合形成輔酶Q10的前體物，該前體物苯環經修飾之后形成目標產物輔酶Q10。在微生物中，合成IPP主要有兩條途徑，分別是真核生物的甲羥戊酸途徑（MVP）和原核生物中的非甲羥戊酸途徑（MEP）。在類球紅細菌中，IPP由MEP途徑合成。

目前國內相關研究主要集中在多基因表達強化大腸桿菌上。尚無專利有關于通過基因過表達強化類球紅細菌輔酶Q10的合成能力。

發明內容

本發明針對微生物發酵法生產輔酶Q10產量較低且生產成本較高等缺點，提供了一種能顯著提高輔酶Q10產量的生產輔酶Q10工程菌及其構建與應用方法。通過引用該方法，可以極大提高應用微生物發酵法生產輔酶Q10的產量，降低了輔酶Q10的生產成本。

為了解決上述技術問題，本發明提供了以下技術方案：

一種生產輔酶Q10的工程菌的構建方法，具體步驟如下：

a.從類球紅細菌中提取基因組DNA；

b.用聚合酶鏈式反應擴增出DXS和DDS的同源基因；

c.用擴增出的同源基因與廣宿主質粒連接，構建重組載體；

d.重組載體轉化至大腸桿菌S17-1中；

e.將S17-1與所述類球紅細菌接合轉移，即得敲除了基因DXS和DDS的工程菌。

作為優選，所述的DXS基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1所示，所述的DDS基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.2所示。

作為優選，所述廣宿主質粒為克隆載體pBBR1MCS-2，所述質粒的啟動子為tac啟動子。

一株利用上述構建方法得到的用于生產輔酶Q10的工程菌，該菌為類球紅細菌，拉丁文學名為Rhodobacter?sphaeroides；命名為NHU-ZDD菌株；保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間：2012年4月13日；保藏編號：CGMCC?No.5998。

應用上述工程菌生產輔酶Q10的方法，具體步驟如下：

f.挑取NHU-ZDD菌株單克隆接種于含10mL種子培養基的50mL搖瓶中，轉速為200rpm，在26-34℃培養23h，獲得一級種子；

g.將一級種子按1%的比例轉接至含20mL種子培養基的50mL搖瓶中，在26-34℃，200rpm的條件下培養23h，獲得二級種子；

h.將二級種子以1%的比例接種至含100mL發酵培養基的500mL中，在26-34℃，200rpm的條件下培養72h后，添加異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），誘導表達48h；收集菌液；可通過常規方法提取輔酶Q10。