[發明專利]一種生產輔酶Q10工程菌的構建方法、工程菌及其應用

有效

• 申請號: 201210201673.4
• 申請日: 2012-06-15
• 公開（公告）號: CN103509729A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 于洪巍;石一軍;陸文強;王昌澤;張建新
• 申請（專利權）人: 浙江新和成股份有限公司;上虞新和成生物化工有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/09;C12P7/66;C12R1/01
• 代理公司: 杭州裕陽專利事務所(普通合伙) 33221
• 代理人: 應圣義

1.一種生產輔酶Q10的工程菌的構建方法，其特征在于，具體步驟如下：

a.從類球紅細菌中提取基因組DNA；

b.用聚合酶鏈式反應擴增出DXS和DDS的同源基因；

c.用擴增出的同源基因與廣宿主質粒連接，構建重組載體；

d.重組載體轉化至大腸桿菌S17-1中；

e.將大腸桿菌S17-1與類球紅細菌接合轉移，即得工程菌。

2.根據權利要求1所述的生產輔酶Q10的工程菌的構建方法，其特征在于：所述的DXS基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1所示；所述的DDS基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.2所示。

3.根據權利要求1所述的生產輔酶Q10的工程菌的構建方法，其特征在于：所述的廣宿主質粒為克隆載體pBBR1MCS-2；所述質粒的啟動子為tac啟動子。

4.一株利用如權利要求1-3任一所述的構建方法得到的工程菌，其特征在于：該菌為類球紅細菌，拉丁文學名為Rhodobacter?sphaeroides；命名為NHU-ZDD菌株；保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間：2012年4月13日；保藏編號：CGMCC?No.5998。

5.利用如權利要求4所述的工程菌生產輔酶Q10的方法，其特征在于，具體步驟如下：

f.?挑取NHU-ZDD菌株單克隆接種于含10mL種子培養基的50mL搖瓶中，轉速為200rpm，在26-34℃培養23h，獲得一級種子；

g.?將一級種子按1%的比例轉接至含20mL種子培養基的50mL搖瓶中，在26-34℃，200rpm的條件下培養23h，獲得二級種子；

h.?將二級種子以1%的比例接種至含100mL發酵培養基的500mL中，在26-34℃，200rpm的條件下培養72h后，添加異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，誘導表達48h，收集菌液；并提取輔酶Q10。

6.利用如權利要求5所述的生產輔酶Q10的方法，其特征在于：所述的種子培養基每100mL中含有：(NH₄)₂SO₄?0.25g，玉米漿?0.05g，酵母提取物?0.14g，NaCl?0.2g，葡萄糖?0.3g，K₂HPO₄?0.05g，KH₂PO₄?0.05g，MgSO₄?0.1g，FeSO₄?0.01g，CoCl₂?0.003g，MnSO₄?0.0001g，CaCO₃?0.8g，維生素B1?0.1μg，維生素K?0.1μg，維生素A?0.15μg；pH調節為7.2。

7.利用如權利要求5所述的生產輔酶Q10的方法，其特征在于：所述的發酵培養基每100mL中含有：(NH₄)₂SO₄?0.3g，NaCl?0.28g，葡萄糖?4g，KH₂PO₄?0.15g，味精?0.3g，MgSO₄?0.63g，玉米漿?0.4g，FeSO₄?0.12g，CoCl₂?0.005g，CaCO₃?0.6g，維生素B1?0.1μg，維生素K?0.1μg，維生素A?0.15μg；pH調節為7.2。

8.利用如權利要求5所述的生產輔酶Q10的方法，其特征在于：所述異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的濃度為0.001-10mM。