[發(fā)明專利]檢測菌體活細(xì)胞的方法及其應(yīng)用以及引物與試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210199850.X
• 申請日: 2012-06-14
• 公開（公告）號: CN103509850A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙亮;任發(fā)政;喬雪微
• 申請（專利權(quán)）人: 任發(fā)政
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 北京潤平知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11283
• 代理人: 王崇;周建秋

1.一種檢測待測樣品中的菌體的活細(xì)胞的方法，所述待測樣品為含有或不含有上述菌體的活細(xì)胞的懸濁液，其特征在于，該方法包括以下步驟：

（1）將所述待測樣品與疊氮溴化丙錠接觸，相對于每ml的所述待測樣品，疊氮溴化丙錠的用量為65-75μg，優(yōu)選為68-72μg，所述接觸包括依次進(jìn)行暗處理和光處理；對接觸后的產(chǎn)物進(jìn)行提取DNA的操作，得到DNA樣品；

（2）在能特異性地使所述菌體的DNA得到擴(kuò)增的條件下，對所述DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增的操作，獲得擴(kuò)增產(chǎn)品；

（3）根據(jù)所述擴(kuò)增產(chǎn)品中菌體DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的量判斷待測樣品中菌體活細(xì)胞的數(shù)量，其中，所述菌體DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的量越多，則指示待測樣品中菌體活細(xì)胞的數(shù)量越多。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述暗處理的條件包括光照強(qiáng)度在0.01lux以下、溫度為20-30℃和時間為2-10min；所述光處理的條件包括光照強(qiáng)度為5×10³-1.01×10⁴lux、溫度為0-10℃和時間為2-6min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述菌體為長雙歧桿菌（Bifidobacterium?longum）。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其中，所述菌體為長雙歧桿菌BBMN68菌株（Bifidobacterium?longum?subsp.longum?BBMN68），該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?NO.2265。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述PCR擴(kuò)增所使用的引物包括SEQ?ID?NO:1所示的正向引物和SEQ?ID?NO:2所示的反向引物。

6.根據(jù)權(quán)利要求1、4或5中任意一項所述的方法，其中，所述待測樣品中菌體的活細(xì)胞的量在10³-10¹⁰CFU/ml范圍內(nèi)。

7.一種引物，其特征在于，該引物包括SEQ?ID?NO:1所示的正向引物和SEQ?ID?NO:2所示的反向引物。

8.一種檢測待測樣品中的菌體的試劑盒，該試劑盒包括PCR擴(kuò)增試劑和引物，其特征在于，所述菌體為長雙歧桿菌BBMN68菌株（Bifidobacterium?longum?subsp.longum?BBMN68），該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?NO.2265，所述引物包括SEQ?ID?NO:1所示的正向引物和SEQ?ID?NO:2所示的反向引物。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其中，所述試劑盒還包括疊氮溴化丙錠和DNA提取試劑。

10.權(quán)利要求1-7中任意一項所述的方法在檢測腸道內(nèi)容物的菌體活細(xì)胞數(shù)中的應(yīng)用。