[發明專利]檢測菌體活細胞的方法及其應用以及引物與試劑盒

有效

• 申請號: 201210199850.X
• 申請日: 2012-06-14
• 公開（公告）號: CN103509850A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 趙亮;任發政;喬雪微
• 申請（專利權）人: 任發政
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 北京潤平知識產權代理有限公司 11283
• 代理人: 王崇;周建秋

技術領域

本發明涉及生物工程（技術）領域，具體地，涉及一種檢測待測樣品中的菌體的活細胞的方法及其在檢測腸道內容物的菌體活細胞數中的應用，以及一種特別適用于檢測長雙歧桿菌（Bifidobacterium?longum）的引物與試劑盒。

背景技術

現有的研究證明，益生菌菌體的死細胞也可在機體中發揮益生功能，但是死細胞不能在胃腸道中定植，一段時間后會隨著排泄物被排出體外；而菌體活細胞可定植于胃腸道中并源源不斷的分泌益生因子，從而能夠對機體發揮更好的益生效果，因此，對益生菌菌體的活細胞的檢測尤為重要。

在現有的技術中，一般采用平板計數法檢測菌體活細胞數，但是平板計數法操作繁瑣且持續時間長，不能快速獲得檢測結果。而且對于含有多種菌體的樣品（如腸道內容物）來說，根本很難利用平板計數法實現特定菌體活細胞的計數。

隨著分子生物學的發展，檢測技術也得到了突飛猛進的發展，近些年發展起來的分子生物學方法如特異性引物設計技術、雜交探針技術、PCR-ELISA技術、16S?RNA技術、TGGE/DGGE技術、RAPD技術和FISH技術，這些技術的發展實現了含有多種菌體的樣品特定菌體的定性和定量檢測，但是這些方法只能檢測樣品中特定菌體的總數量，均難以實現特定菌體的活細胞計數。

疊氮溴化丙錠（PMA）和疊氮溴化乙錠（EMA）是兩種對DNA和RNA具有高度親和力的光敏染料。PMA和EMA可選擇性的進入細胞膜破損的非活性細胞內部，并與非活性細胞的DNA共價結合，在強光的照射下通過疊氮基團與DNA進一步形成牢固的共價結合，從而抑制其PCR反應，由于PMA和EMA會被阻隔在活性菌體的完整細胞膜之外，使得定量PCR（qPCR）只能檢測到細胞壁完整的活菌體，而細胞壁不完整的非活性細胞菌體則無法檢測到。以上過程均完成于DNA提取之前，未與DNA結合的游離PMA和EMA在強光的照射下與水分子反應從而被除去，對后續的PCR和DNA測定不會造成影響，最后利用qPCR完成對細菌活細胞的檢測。因此，PMA和EMA與qPCR的結合可以成為對活細胞量化分析強有力的工具。然而Nocker等（2006）通過對李斯特菌的研究發現，EMA具有較強的細胞毒性，因而會在很大程度上影響檢測結果，所以EMA并不是理想的檢測材料；而PMA對各種菌體活細胞的毒害作用及其使用濃度缺乏理論基礎，尚待進一步研究。

長雙歧桿菌BBMN68菌株（Bifidobacterium?longum?subsp.longum?BBMN68）分離自長壽老人的糞便中，是一株具有良好益生功能的的益生菌，研究發現，該菌株具有良好的耐酸耐膽鹽性能、良好遺傳穩定性、對機體安全無毒害作用、提高巨噬細胞的吞噬作用、促進小鼠胃腸道消化吸收功能、增強小鼠腸道免疫屏障、調節機體免疫系統、延緩秀麗線蟲的衰老等功能，可以看出該菌株對人體健康有著重要的意義，所以研究檢測該菌株的菌體活細胞的檢測方法特別是試劑盒具有重要的價值。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種檢測待測樣品中菌體的活細胞的方法及其應用以及引物與試劑盒。

為了實現上述目的，一方面，本發明提供一種檢測待測樣品中的菌體的活細胞的方法及其在檢測腸道內容物的菌體活細胞數中的應用，所述待測樣品為含有或不含有上述菌體的活細胞的懸濁液，其特征在于，該方法包括以下步驟：

（1）將所述待測樣品與PMA接觸，相對于每ml的所述待測樣品，PMA的用量為65-75μg，優選為68-72μg，所述接觸包括依次進行暗處理和光處理；對接觸后的產物進行提取DNA的操作，得到DNA樣品；

（2）在能特異性地使所述菌體的DNA得到擴增的條件下，對所述DNA樣品進行PCR擴增的操作，獲得擴增產品；

（3）根據所述擴增產品中菌體DNA的擴增產物的量判斷待測樣品中菌體活細胞的數量，其中，所述菌體DNA的擴增產物的量越多，則指示待測樣品中菌體活細胞的數量越多。

另一方面，本發明提供一種引物，其特征在于，該引物包括SEQ?ID?NO:1所示的正向引物和SEQ?ID?NO:2所示的反向引物。