[發明專利]用于檢測和測定小檗堿的抗體、方法和試劑盒

在審

• 申請號: 201210197148.X
• 申請日: 2012-06-15
• 公開（公告）號: CN103483444A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 王慶國;趙琰;屈會化;王雪茜;續潔琨;張越;吳婷婷;孫慧;李翼飛
• 申請（專利權）人: 北京中醫藥大學
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K14/77;C07K14/795;C07K14/47;C08B37/00;C12N1/16;C07K16/44;G01N33/531;G01N33/577
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技術領域

本發明涉及小分子半抗原的抗體及其制備方法與應用，特別是涉及小檗堿及其衍生物的抗體及其制備方法與應用。

背景技術

本發明涉及用于檢測和定量小檗堿的方法和試劑盒，以及其中使用的半抗原、免疫原、包被原和抗體。

其中“檢測”是指定性分析物質是否存在。

其中“測定”是指對物質進行定量分析。

小檗堿是一種季銨生物堿，分子式[C20H18NO4]+Cl-，分子量371.8。又稱黃連素。存在于黃連以及其它小檗屬植物中。黃色針狀結晶。熔點145℃?？扇苡跓崴⒁掖?、難溶于乙醚、苯。能與氯仿和丙酮等生成復合物。又稱黃連素。常用其鹽酸鹽。黃色結晶性粉末。無臭，味極苦。微溶于水，不溶于醚、氯仿、醇等。

藥理作用

現代藥理學研究表明其抗菌譜廣，體外對多種革蘭陽性及陰性菌均具抑菌作用，其中對溶血性鏈球菌、金葡菌、霍亂弧菌、腦膜炎球菌、志賀痢疾桿菌、傷寒桿菌、白喉桿菌等有較強的抑制作用，低濃度時抑菌，高濃度時殺菌。對流感病毒、阿米巴原蟲、鉤端螺旋體、某些皮膚真菌也有一定抑制作用。體外實驗證實黃連素能增強白細胞及肝網狀內皮系統的吞噬能力。痢疾桿菌、溶血性鏈球菌、金葡菌等極易對本品產生耐藥性。本品與青霉素、鏈霉素等并無交叉耐藥性。小檗堿的鹽酸鹽(俗稱鹽酸黃連素)已廣泛用于治療胃腸炎、細菌性痢疾等，對肺結核、猩紅熱、急性扁桃腺炎和呼吸道感染也有一定療效。中醫常用黃連、黃柏、三顆針及十大功勞等作清熱解毒藥物，其中主要有效成分即小檗堿。

小檗堿化學結構如下：

目前建立了多種小檗堿的定性與定量檢測和測定分析方法，如薄層層析法、HPLC法，HPLC-MS法等。其中最常用的方法是高效液相色譜法。但含小檗堿的生物樣品(包括血漿、尿、唾液等)含有大量的影響含量測定的蛋白質及內源性物質；同時小檗堿可能呈結合狀態，必須經過處理，排除內源性雜質和代謝物的干擾，使結合狀態的小檗堿游離后才能測定；同時還需要濃縮以滿足儀器檢測靈敏度的要求，處理程序復雜，費時費力；同時由于小檗堿進入體內后，組織中的分布是極其微量的，即使經過富集，進行含量測定仍是極其困難的。另外，對于小檗堿在靶器官和組織中分布，以及細胞和亞細胞定位的研究，需要通過免疫組織化學和westblot等方法，但由于缺乏小檗堿的抗體，阻礙了此方面的研究。因此，有必要開發出一種用于檢側和測定生物樣品中小檗堿的方法，對闡明相關藥材或復方的作用機理，以及其體內分布和代謝研究，將具有特別的價值。

發明內容

本發明的半抗原小檗堿可提供確定的結構性抗原決定部位，但是它本身并不具備免疫原性，因此必須要偶聯到適宜的賦予抗原性的載體物質上，這樣所形成的免疫原才會在注射到宿主動物體內后誘發免疫應答。因此，本發明提供一種如下結構的免疫原：

其中R是0至6個碳的烷基橋(連接半抗原與載體物質的橋)，優選R＝0，即P1直接與小檗堿羰基碳原子結合，或R是C1-C6取代或未取代的、直鏈或支鏈的、飽和或不飽和的亞烷基，更優選R是C1-C4未取代的、直鏈的、飽和的亞烷基。

P是賦予抗原性的載體物質。載體物質選自蛋白質、蛋白質片合成的多肽或半合成的多肽。其中蛋白質、蛋白質片段選自白蛋白、血清蛋白、球蛋白、目鏡蛋白和脂蛋白，優選為牛血清白蛋白、卵清蛋白、牛丙種球蛋白、甲狀腺素結合球蛋白、鎖眼形血藍蛋白(keyhole?limpet?haemocyanin，KLH)，更優選自鎖眼形血藍蛋白或牛血清蛋白(BSA)。合成多肽或半合成多肽是具有足夠數量的可利用氨基的合成聚氨基酸，優選多聚賴氨酸。合成或天然聚合物是帶有反應官能基的聚合物材料，特別是能夠結合到半抗原產生免疫原的碳水化合物、酵母或多糖。

半抗原的制備本發明描述了將小檗堿進行結構改造后，得到9-O-羧甲基-小檗紅堿，并用碳二亞胺法將半抗原與賦予抗原性的載體物質發生的偶聯作用，產生免疫原。以小檗堿為起始原料，特定溫度加熱產生的混合物溶解于水，用三倍量的氯仿提取。氯仿被蒸發，殘渣經Sephadex?LH20和ODS凝膠柱色譜純化得到小檗紅堿。之后，在室溫條件下向小檗紅堿的氯仿溶液添加氯乙酸攪拌反應三小時，溶劑被蒸發后，殘渣經層析得到9-O-羧甲基-小檗紅堿，產物純化經核磁共振氫譜和碳譜(1HNMR和13CNMR)確證。

免疫原的合成