[發明專利]一種β-1,3-1,4-葡聚糖酶及其編碼基因

有效

• 申請號: 201210196700.3
• 申請日: 2012-06-15
• 公開（公告）號: CN102719415A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 王金晶;劉曉玲;李崎;李永仙;劉春鳳;鄭飛云
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12R1/19
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明涉及一種β-1,3-1,4-葡聚糖酶及其編碼基因，屬于酶基因工程和酶工程領域。

技術背景

中國是世界第一大啤酒生產國，2011年啤酒產量達到4900萬千升，年需求啤酒大麥350萬噸，并以每年10%的速度遞增。由于我國啤酒大麥質量不高，每年平均進口啤酒大麥100萬噸，約占世界啤酒大麥總貿易量的30%左右，耗外匯3.5億美元。啤酒大麥絕大部分靠進口的局面，使我國啤酒行業的效益直接受到國際大麥行情的制約，影響到我國啤酒工業的持續發展。因此，啤酒大麥的國產化戰略受到高度重視。發展我國啤酒大麥的生產，一方面需要依靠農業科技的進步，走品種改良引進、高產優質栽培之路，另一方面，就是要變革制麥工藝、釀造工藝，實現低等國產大麥的充分利用，調動農民種植積極性。糖化過程中添加能夠水解大麥β-葡聚糖的β-1,3-1,4-葡聚糖酶，大大降低了糖化過程中的能耗、提高麥汁得率、改善成品啤酒的品質，使得啤酒廠能夠以國產麥芽部分或全部替代進口大麥。我國年產啤酒大麥約為200萬噸，目前僅有30％用于釀造工業，如果該三功能酶制劑得到普遍推廣，預計可以實現70％的分流，其社會意義十分重大。目前國內也有部分酶制劑公司生產β-1,3-1,4-葡聚糖酶，但其水平遠不及國外酶制劑公司，且酶制劑的生產菌種及工藝都是商業機密，國內研發速率緩慢，所以國內市場在很大程度上依然依賴進口。隨著中國啤酒工業的大幅度發展，開發活力高、價格低的國產酶制劑十分必要。工業化產品可以填補國產高效廉價β-1,3-1,4-葡聚糖酶的空白，為我國釀造用酶制劑的發展做出了新表率，對于將該酶種大量應用在啤酒釀造工業上有重大的意義。

目前諾維信公司生產的復合酶價格在198-380元/公斤左右，由于價格太高，啤酒廠根本無法采用。如果價格能夠下降到啤酒廠能夠接受的水平，即100元/公斤左右，則國內啤酒廠可以大幅度推廣使用該產品。根據測算，國內啤酒企業的需求量在1500噸左右，隨著國產大麥麥芽使用量的進一步增大，該酶用量還會進一步提高，市場潛力在1.5億元/年。同時，該酶制劑還是良好的飼料添加用酶。

目前β-1,3-1,4-葡聚糖酶制劑大多使用真菌發酵生產，細菌來源的較少。篩選能夠產生大量β-1,3-1,4-葡聚糖酶的細菌也具有積極意義。但野生菌產量較多，是因為其胞外蛋白酶系較為豐富，抑制了β-1,3-1,4-葡聚糖酶的合成，將此酶基因單獨表達，并進行基因以及酶學性質方面的研究，為β-1,3-1,4-葡聚糖酶的規模化生產及推廣具有深遠的技術指導意義。

發明內容

本發明要解決的一技術問題是提供一種水解大麥β-葡聚糖的β-1,3-1,4-葡聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發明要解決的另一個技術問題是提供一種編碼的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

此外，本發明還提供了一種生產的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的方法，具體包括如下步驟：首先采用化學全合成或PCR方法獲得SEQ?ID?NO.2所示核苷酸序列；克隆獲得的核苷酸序列到pET28a(+)表達載體；然后將獲得的表達載體轉化E.coli?BL21獲得表達的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因工程菌；最后通過優化發酵工藝，將獲得的基因工程菌在LB培養基中37℃液體培養過夜，后接入TB發酵液體培養基37℃培養2h后用4mg/L?IPTG及終濃為10mmol/L乳糖誘導，降溫至25℃培養，24h時離心收集上清酶液。

包含本發明β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的表達載體屬于本發明要求保護的范圍。

包含本發明提供的表達載體的細胞系或基因工程菌也為本發明要求保護的范圍。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活的測定采用改良AZO方法，測定原理及步驟為。

帶藍色基團的大麥β-葡聚糖，在β-葡聚糖酶的作用下，由于β-葡聚糖大分子中的β-1,3-1,4鍵的斷裂，將藍色基團釋放到反應體系中，加入特定的沉淀液后，經過離心，清液在590nm處具有吸光值，且吸光值的大小直接與酶活力的高低成正比。