[發明專利]香蕉枯萎病菌4號小種的LAMP檢測引物及其應用

無效

• 申請號: 201210196132.7
• 申請日: 2012-06-14
• 公開（公告）號: CN102690887A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發明（設計）人: 陳慶河;李本金;翁啟勇;蘭成忠
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明屬于植物病害的分子生物學檢測領域，具體涉及一種香蕉枯萎病菌4號小種的LAMP檢測引物及其應用。

背景技術

由尖鐮孢菌古巴專化型（Fusarium?oxysporum?f.sp.?cubense）引起的香蕉枯萎病是一種毀滅性土傳病害，也是我國進口檢疫對象之一。1904年在美國夏威夷首次報道發現該病害，1910年在巴拿馬因該病造成重大損失，目前該病害已廣泛分布世界產香蕉國家。我國大陸于1960年在廣西的西貢蕉上首先發現該病，不久國內各重要焦區都相繼發生此病害，近年來在福建也發現香蕉枯萎病，并且有繼續擴展蔓延的態勢。其侵染來源主要是帶菌的吸芽、病株殘體及帶菌土壤。該病菌可通過病株殘體、耕作工具、帶菌土壤以及病區灌溉水、雨水、蟲等進行近距離傳播蔓延，帶病菌的吸芽、土壤及二級苗是遠距離傳播的方式。據報道香蕉枯萎病菌有4個生理小種，其中以1號小種和4號小種對生產造成嚴重危害。

近年來，隨著農產品貿易及海峽兩岸農業交流的發展，從香蕉枯萎病疫區國家或地區引進農產品及種苗的種類和數量迅速增加，香蕉枯萎病菌也隨著這些植物產品及植物在貿易中傳入，并對我國農業發展和農產品貿易構成了嚴重的威脅。目前，防治香蕉枯萎病的方法主要是加強檢測、檢疫，嚴防帶病種苗進入無疫區，推廣種植無病組培苗，定期檢查蕉園，發現零星病株應及時清除銷毀，并撒施石灰或尿素處理土壤；種植抗病和耐病的香蕉品種；重病區則應輪作其它作物如水稻、花生、甘蔗等經濟作物。該病害的檢疫檢測技術是以往研究中的薄弱環節，因此，國內外目前仍無十分有效的辦法控制香蕉枯萎病擴散蔓延為害，同時，無病種苗生產基地的建設對于無疫區農作物，尤其是果樹等多年生作物香蕉枯萎病的防治至關重要，因此為了及時堵截國外病原菌的傳入，防止香蕉枯萎病從疫區傳入非疫區，建立一套穩定、可靠、簡便、快速、靈敏的分子檢測方法對香蕉苗及種植地區土壤進行檢測和監測是十分必要的。

傳統的植物病原的檢疫檢測技術由于簡便、易行，目前仍被采用，但由于靈敏度低和耗時長，已經不能滿足新形勢下植物病害診斷和病害控制工作的需要，迫切需要新型檢測技術與之配套。近年來各國均致力于分子生物學檢測技術的研究，取得了很大的進展，其中以多聚酶鏈式反應（PCR）技術為基礎的病原檢測方法已經成功應用于多種植物病原的檢測和鑒定。植物病原生物的PCR分子檢測技術是當前該領域的發展方向，許多重要病原生物都已經建立了分子檢測技術，越來越多的分子檢測試劑盒已經或正在被研制。由于客觀原因，我國雖然在植物病原生物分子檢測技術方面起步較晚，但目前也研制出了許多用于植物病原生物檢測的技術，尤其是一些擁有自主知識產權的檢測方法，并將之投入到商業生產和應用中。

目前已有一些利用分子手段鑒定香蕉枯萎病菌，即尖鐮孢菌古巴專化型（Fusarium?oxysporum?f.sp.?cubense）的方法，John?A.等報道了香蕉枯萎病菌基于多重PCR的分子檢測；廖林鳳等報道了用隨機擴增多態性DNA(RAPD)技術，從90個RAPD隨機引物中篩選出引物進行RAPD-PCR擴增，并設計特定引物作為香蕉枯萎病菌4號小種的特異性SCAR標記；劉景梅等用RAPD技術,從200條隨機引物中篩選出8條引物可產生生理小種RAPD標記12個,根據這些特異片段序列分別設計相應的SCAR引物,通過對18個菌株的PCR擴增檢驗,有4個RAPD標記成功地轉化為SCAR標記,其中Race?1-SCAR標記1個、Race?4-SCAR標記2個、同時能鑒定出?2個小種的SCAR標記1個；呂偉成等對香蕉枯萎病菌遺傳多樣性進行分析，構建了香蕉枯萎病菌生理小種ITS-SCAR雙重PCR檢測體系，該方法可以同時檢測香蕉枯萎病菌1號和4號生理小種；葉建軍等構建了以ITS測序與SCAR分子標記相結合的香蕉病原菌FOC4分子檢測方法；王國芬、葉明珍、漆艷香、陳靜華等根據ITS序列、16SrDNA序列、β-微管蛋白基因(β-tubulin)保守序列等設計特異引物檢測香蕉枯萎病菌。

目前PCR特異性檢測技術仍然需要PCR儀、電泳和凝膠成像系統等昂貴的專業儀器和分子生物學試劑，且需要分子生物學專業實驗人員操作，以上檢測只能在實驗室條件下才可以進行，限制了PCR檢測方法在生產中的推廣應用。