[發明專利]香蕉枯萎病菌4號小種的LAMP檢測引物及其應用

無效

• 申請號: 201210196132.7
• 申請日: 2012-06-14
• 公開（公告）號: CN102690887A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發明（設計）人: 陳慶河;李本金;翁啟勇;蘭成忠
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種香蕉枯萎病菌4號小種的LAMP檢測引物，其特征在于：所述引物如下：

外側引物F3：5’?-AGGACCTCTTCGAATGGCA-?3’，

B3：5’?-GACGCTGCAGCTATGACAA-?3’；

內側引物FIP：5’?-GGTGGCTCAATAGCCCAGTGAACCGATACCTGTGAAGTCGC-?3’，

BIP：5’?-CGACATCATCAGCATCTCCGCTAGCTTTGGCTCTTGTGACAG-?3’；

環引物F-loop：5’?-?GCCTAATTGAACATTCAGTATAAAC-?3’，

B-Loop：5’?-?ACTCCAAGGAACTAGACGACG?-?3’。

2.一種香蕉枯萎病菌4號小種的LAMP檢測方法，包括引物設計、LAMP擴增和擴增結果觀察，其特征在于：所述LAMP檢測方法的反應體系包括：引物混合液、反應混合液、1.0U?Bst?DNA聚合酶和25ng?DNA模板，用滅菌雙蒸水補足到25?uL；所述引物混合液由權利要求1所述的外側引物F3、B3，內側引物FIP、BIP和環引物B-loop、F-loop組成，其中外側引物F3和B3各5pmol，內側引物FIP和BIP各40?pmol，環引物B-loop、F-loop各20μmol；所述反應混合液配制如下：40mM?Tris-HCL，20mM?(NH₄)₂SO₄，20mM?KCL，16?mM?MgSO₄，0.2%?Triton?X-100，1.6M?甜菜堿和2.8?mM?dNTPs。

3.根據權利要求2所述的香蕉枯萎病菌4號小種的LAMP檢測方法，其特征在于：所述LAMP檢測方法的反應條件為在60-65℃溫育60?min，80-85℃保溫10min。

4.根據權利要求2所述的香蕉枯萎病菌4號小種的LAMP檢測方法，其特征在于：所述擴增結果觀察為熒光染料目測觀察法或瓊脂糖凝膠電泳法；所述熒光染料目測觀察法：在LAMP反應的最終擴增產物中加入1uL顯色劑，所述顯色劑為SYBR?greenⅠ，顯色結果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性；所述瓊脂糖凝膠電泳法：取2uLLAMP反應的最終擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現擴增條帶判斷為陰性。

5.一種香蕉枯萎病菌4號小種特異性的檢測試劑盒，其特征在于：所述LAMP檢測試劑盒包括：

1）引物混合液：外側引物F3和B3各5pmol，內側引物FIP和BIP各40?pmol,?環引物B-loop和F-loop各20μmol；

2）反應混合液：40mM?Tris-HCL，20mM?(NH₄)₂SO₄，20mM?KCL，16?mM?MgSO₄，0.2%?Triton?X-100，1.6M?Betaine，2.8?mM?dNTPs；

3）1.0U?Bst?DNA聚合酶。

6.根據權利要求5所述的香蕉枯萎病菌4號小種的LAMP檢測試劑盒，其特征在于：所述LAMP檢測試劑盒還包括顯色劑，所述的顯色劑為SYBR?greenⅠ。

7.根據權利要求5所述的香蕉枯萎病菌4號小種的LAMP檢測試劑盒，其特征在于：所述LAMP檢測試劑盒還包括從罹病香蕉枯萎病植物組織或土壤中提取DNA的提取試劑，由2%?CTAB、10%?SDS、體積比為25:24:1的酚/氯仿/異戊醇混合液、氯仿、3M?NaAC、0.4%?脫脂奶粉溶液、7.5?M?NH₄AC、10mg/ml蛋白酶K、無水乙醇、70%乙醇、1×TE組成。