[發明專利]枇杷木質素代謝相關乙烯響應因子克隆與轉錄調控方法

有效

• 申請號: 201210195408.X
• 申請日: 2012-06-14
• 公開（公告）號: CN102747068A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發明（設計）人: 陳昆松;徐倩;閔婷;殷學仁;孫崇德
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/29;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術領域

本發明屬于果實貯藏與植物分子生物技術領域，涉及枇杷木質素代謝相關乙烯響應因子克隆與轉錄調控方法。?

背景技術

枇杷（Eriobotrya?japonica?Lindl.）是原產我國的薔薇科常綠果樹，屬于非躍變型果實。不同于其他果實在采后軟化的過程，紅肉枇杷在采后貯藏過程中會出現木質化現象，造成果實硬度上升、風味變淡、粗糙少汁等，嚴重影響了果實品質與經濟價值。0～5℃低溫能顯著抑制枇杷果實的呼吸和乙烯釋放，從而延長貨架期，但是在0～1℃會使果實發生冷害，反而會加速枇杷果實木質化的產生。程序降溫（LTC），即先將枇杷果實于5℃貯藏6天，然后再轉到0℃貯藏，可以減輕冷害，減緩木質素的生成。熱激處理（HT）是將果實經過40℃的4h處理之后放入0℃貯藏，也可以減輕果實的木質化進程。

乙烯是一種重要的植物激素，參與植物生長的整個過程，包括種子萌發、花的發育與分化、果實的成熟與衰老等過程，同時乙烯還是一種信號物質，參與植物對各種生物或是非生物（環境）脅迫的反應。在乙烯信號轉導過程中，乙烯響應因子（ERF）位于信號轉導途徑的末端，直接誘導或是抑制目標基因的表達，并且可能順式調控其他轉錄因子，從而實現乙烯的生物學效應。如在番茄中，通過抑制番茄LeERF1基因表達可有效延緩番茄果實成熟，同時LeERF2可特異調控乙烯合成基因，進而反饋調控乙烯合成。果實在低溫、短時高溫等逆境環境中會產生一定的防御反應，其中ERF可能是響應的基因之一，不同的逆境環境中可能有不同的ERF基因家族成員進行響應。枇杷果實低溫貯藏中，ERFs家族成員調控木質化的生物學機制尚不清楚。

發明內容

本發明的目的是提供一種枇杷木質素代謝相關乙烯響應因子克隆與轉錄調控方法，通過以下步驟實現：克隆得到乙烯響應因子（ERF）基因家族成員，以及這些成員在枇杷果實采后冷藏過程中表達量的變化情況，得到調控木質素合成有關的ERF轉錄因子成員，豐富枇杷果實乙烯信號轉導途徑的理論內容，并為果實保鮮提供新途徑。

本發明的具體實施步驟如下：

1、枇杷乙烯響應因子序列的獲得：根據華大公司深度測序返回的結果中，查找到與乙烯相關的Unigene?約395條，其中與AP2/ERF乙烯響應因子有關的Unigene?共164條。將這164條Unigene?翻譯的蛋白序列在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進行蛋白序列的比對（protein?blast），篩選出含有一個完整AP2結構域的Unigene。

2、乙烯響應因子3’末端序列的獲得：參照Clontech公司SMART?RACE?cDNA?Amplification試劑盒說明書，合成3’cDNA模板并根據說明書要求在http://frodo.wi.mit.edu/primer3/網站上設計相應基因的特異3’末端引物，每個基因設計兩個特異引物，分別為內側引物、外測引物，引物序列見SEQ?ID?NO:1-32，下游引物參照試劑盒說明書提供的通用引物。對3’?cDNA模板進行2次PCR，第二次PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，用Takara公司瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后，與pMD18-T載體過夜連接，轉化到大腸桿菌DH5ɑ感受態細胞，用100mg/ml青霉素的LB板上篩選陽性克隆，并對篩選出的陽性克隆進一步用載體引物進行菌落PCR確定后，送上海英俊公司測序。測序列結果用CLUSTALX軟件與已有的Unigene進行比對，共獲得32條ERF相關基因的3’末端序列。

3、枇杷果實的RNA的提取采用CTAB法提取。粗提的RNA用TURBO?DNase?(Ambion)?去除其中的DNA,?取1?μl去DNA的RNA用Nanophotometer?Pearl?(Implen)?定量后，取3?μg用RevertAid??First?Strand?cDNA試劑盒（Fermentas）逆轉錄成cDNA，用于定量PCR。

4、以冷敏性紅肉枇杷洛陽青（LYQ）為材料進行以下3個處理：直接0℃貯藏，熱激（HT，40℃4h后轉入0℃貯藏），程序降溫（LTC，5℃6d后轉入0℃貯藏）。檢測3個處理過程中硬度、木質素含量的變化情況。

5、對篩選出的32個乙烯響應因子（ERF）用在線網站?http://frodo.wi.mit.edu/primer3/設計定量PCR的引物，引物序列見SEQ?ID?NO:33-64。以枇杷管家基因Actin作為內參基因，序列參見SEQ?ID?NO:65。處理前的起始點表達量為1，計算方法采用△△Ct相對定量的方法計算3個處理過程中ERF基因的表達量。