[發明專利]枇杷木質素代謝相關乙烯響應因子克隆與轉錄調控方法

有效

• 申請號: 201210195408.X
• 申請日: 2012-06-14
• 公開（公告）號: CN102747068A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發明（設計）人: 陳昆松;徐倩;閔婷;殷學仁;孫崇德
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/29;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

1.枇杷木質素代謝相關乙烯響應因子克隆與轉錄調控方法，其特征在于，通過以下步驟實現：

（1）枇杷乙烯響應因子序列的獲得：根據華大公司深度測序返回的結果，一共查找到與乙烯相關的Unigene?約395條，其中與AP2/ERF乙烯響應因子有關的Unigene?共164條，將這164條Unigene?翻譯的蛋白序列在NCBI中進行蛋白序列的比對，篩選出含有AP2結構域的Unigene；

（2）乙烯響應因子3’末端序列的獲得：參照Clontech公司SMART?RACE?cDNA?Amplification試劑盒說明書，合成3’cDNA模板并根據說明書要求設計相應基因的特異3’末端引物，每個基因設計兩個特異的上游引物，分別為內側引物、外測引物，引物序列見SEQ?ID?NO:1-32，下游引物參照試劑盒說明書提供的通用引物，對3’cDNA模板進行2次PCR，第二次PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，用Takara公司瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后，與pMD18-T載體過夜連接，轉化到大腸桿菌DH5ɑ感受態細胞，用100mg/ml青霉素的LB板上篩選陽性克隆，并對篩選出的陽性克隆進一步用載體引物進行菌落PCR確定后測序，一共得到32條ERF相關基因的3’末端序列；

（3）枇杷果實的RNA的提取采用CTAB法提取，粗提的RNA用TURBO?DNase去除其中的DNA，取1?μl去DNA的RNA用Nanophotometer?Pearl定量后，取3?μg用RevertAid??First?Strand?cDNA試劑盒逆轉錄成cDNA，用于定量PCR；

（4）以冷敏性紅肉枇杷洛陽青為材料進行以下3個處理：直接0℃貯藏；熱激，即40℃?4小時后轉入0℃貯藏；程序降溫，即5℃?6天后轉入0℃貯藏；檢測3個處理過程中硬度、木質素含量的變化情況；

（5）對篩選出的32個乙烯響應因子用在線網站?http://frodo.wi.mit.edu/primer3/設計定量PCR的引物，引物序列見SEQ?ID?NO:33-64，以枇杷管家基因Actin作為內參基因，引物序列見SEQ?ID?NO:65，處理前的起始點表達量為1，計算方法采用△△Ct相對定量的方法計算3個處理過程中ERF基因的表達量；

（6）結合紅肉枇杷洛陽青果實貯藏的三個處理中（0℃、熱激、程序降溫）的硬度、木質素含量的變化情況以及ERF基因的表達情況，篩選出2個與枇杷果實木質化進行有一定相關性的ERF基因，分別為SEQ?ID?NO:66和SEQ?ID?NO:67。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2）所述二次PCR的第一次反應參數為：10×ExBuffer?2?μL，2.5mmol/L?dNTPs?1.6?μl，外測引物UPM?2?μL，10μmol/L特異外測引物0.5?μl，ExTaq聚合酶0.1?μL，加滅菌的雙蒸水至20?μL，Touchdown?PCR反應條件為:?反應條件為94℃預變性5?min；94℃變性30?s，72℃，150?s，5個循環；94℃變性30?s，68℃退火30?s，72℃延伸150?s，5個循環；94℃變性30?s，65℃退火30?s，72℃延伸150?s，25個循環；最后72℃延伸10?min；

第二次反應參數為：10×ExBuffer?2?μL，2.5mmol/L?dNTPs?1.6?μl,內測引物NUP?2μL，10μmol/L特異內測引物0.5?μl,ExTaq聚合酶0.1?μL，加滅菌的雙蒸水至20?μL，94℃預變性5?min；94℃變性30?s，58℃退火30?s，72℃延伸90?s，35個循環；最后72℃延伸10?min。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（5）所述的計算基因表達量的方法是：以枇杷管家基因Actin作為內參基因，處理前的起始點表達量為1，計算方法采用△△Ct相對定量的方法；反應體系為SsoFast?EvaGreen?supermix?10μl,10?Mm的上下游引物各1μl，模板2μl，加無菌水至20μl；反應程序為95℃預變性30?s；95℃變性5s,60℃退火5?s，45個循環。