[發(fā)明專利]一種ɑ-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白及制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210195131.0
• 申請(qǐng)日: 2012-06-13
• 公開（公告）號(hào): CN102703399A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡傳奇;郭海軍;閆宇鵬;云升;王云虹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京京蒙高科干細(xì)胞技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/10
• 分類號(hào): C12N9/10;C12N1/21;C12N15/62;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 馮瓊;李玉秋

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，涉及一種糖基轉(zhuǎn)移酶，具體涉及一種α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白，其催化α-半乳糖表位的形成。?

背景技術(shù)

α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶存在于一些動(dòng)物如牛，鼠等體內(nèi)，人類不具備此酶。該酶在特定的底物上形成α-1，3半乳糖基后成為一種能被人體內(nèi)天然存在的抗體所識(shí)別的表位，此表位通常稱為α-半乳糖表位；這是人類異體移植產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)的生物學(xué)基礎(chǔ)，因此，α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶可用于合成抗免疫排斥反應(yīng)的藥物。?

后來研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過該酶修飾處理后的人體腫瘤細(xì)胞等能更有效地被自身免疫系統(tǒng)所識(shí)別，進(jìn)而更有效地被清除，這種修飾的細(xì)胞或細(xì)胞碎片因此被稱為自體疫苗。?

基于上述原因，提供大量并有活性的α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶具商業(yè)意義。到目前為止，α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在細(xì)菌中表達(dá)均形成包涵體，或絕大部分形成包涵體，即不可溶的非活性的狀態(tài)。雖然利用蛋白質(zhì)的復(fù)性及變性方法可以改變蛋白質(zhì)的不可溶的非活性的狀態(tài)，但其費(fèi)時(shí)費(fèi)力，效果差且污染環(huán)境。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題為不采用蛋白質(zhì)的復(fù)性及變性技術(shù)方案而實(shí)現(xiàn)α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在細(xì)菌中具生物活性的可溶性表達(dá)。?

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種融合蛋白，由TRX蛋白與α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合形成，具有催化α-半乳糖表位形成活性。?

硫氧還蛋白(thioredoxin,Trx)是一種具有氧化還原活性的小分子蛋白質(zhì),分子質(zhì)量12kD,廣泛存在于所有生物體中。作為機(jī)體內(nèi)一種重?要的氧化還原調(diào)節(jié)蛋白，硫氧還蛋白（TRX）具有多種生物學(xué)功能。TRX是非常有效的自由基清除劑，能保護(hù)細(xì)胞免受諸如腫瘤壞死因子(TNF)以及H₂O₂等引起的氧化損傷。此外，TRX還通過修復(fù)受損傷的蛋白、抑制凋亡和調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用。目前研究證實(shí)TRX在組織的缺血再灌注損傷和神經(jīng)退行性病變的防治中發(fā)揮了重要作用。?

在實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)方案過程中，具體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)施方式可以是在本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的知識(shí)和方法范圍內(nèi)作任何等同的替代或變換或改變，并不限于該申請(qǐng)文件所具體陳述的范圍。例如，α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因，除了通常用全長基因外，還可以用其功能域。我們已用了一種功能域，當(dāng)然還有其他氨基酸多一些或少一些的功能域，只要功能域保持催化α-半乳糖表位形成的功能（催化結(jié)構(gòu)功能）即可。類似等同的替代或變換或改變，在此不一一列舉。?

作為優(yōu)選，所述α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶包括其催化結(jié)構(gòu)功能域α1,3GTcd部分。?

更優(yōu)選地，所述α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶還包括用于純化的序列。?

為了進(jìn)一步簡化α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白的純化，本發(fā)明所述融合蛋白還可以包含任何本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知的例如GST或His-tag等蛋白或結(jié)構(gòu)功能域。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的上游設(shè)計(jì)選擇了His-tag以便后續(xù)純化之用，當(dāng)然His-tag也可設(shè)計(jì)在整個(gè)融合蛋白的上游或下游，或者使用其他純化功能的蛋白序列。?

本發(fā)明所述的融合蛋白，其為可溶狀態(tài)。?

在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，提供的融合蛋白氨基酸序列如SEQ?ID?No.3所示。?

本發(fā)明為了避免包涵體的形成，直接在細(xì)菌中產(chǎn)生可溶性的具有酶學(xué)活性的蛋白，采取了如下技術(shù)方案：?

克隆α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因，把該基因直接克隆到常用的表達(dá)載體上，結(jié)果形成了包涵體；更改不同的載體或者更改不同的受體?菌仍然形成包涵體；接著，借助于蛋白融合技術(shù)，把該基因與TRX基因，即一種氧化還原蛋白thioredoxin基因融合在一起，使α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶以融合蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果該融合蛋白在通常的各種培養(yǎng)條件下均形成可溶性表達(dá)，并且重要的是：該融合蛋白完全具有α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性。另外，本發(fā)明所述融合蛋白的表達(dá)量較高，占可溶性細(xì)菌裂解物的20%以上。?

本發(fā)明還提供產(chǎn)生根據(jù)所述α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白的細(xì)菌。作為優(yōu)選，其為大腸桿菌DH5α或大腸桿菌BL21（DE3）。?

本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)所述α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白的方法。?