[發(fā)明專利]一種重組染色質(zhì)修飾蛋白1A及其編碼基因和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210194127.2
• 申請日: 2012-06-12
• 公開（公告）號: CN102718856A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 由振強;宣堯仙;辛艷飛;張立將;陳云祥;陳國燦;楊紅忠;陳穎;周國亮;李峰;徐潘生
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/12;C12N15/81;C12N1/19;A61K38/17;A61K47/48;A61P35/00;C12R1/84
• 代理公司: 杭州天勤知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種重組蛋白，尤其涉及一種重組染色質(zhì)修飾蛋白1A及其編碼基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)

(一)Chmp1A生物學(xué)特性

染色質(zhì)修飾蛋白1A(Chromatin?modifying?protein?1A，Chmp1A)屬于ESCRT-III復(fù)合物家族成員。ESCRT-III成分及其相關(guān)蛋白統(tǒng)稱為Chmps，所有的Chmps蛋白有相似的結(jié)構(gòu)：均編碼一個大約200個氨基酸的ORF；具有一個coiled-coil區(qū)域和ujnnnnnn電荷基團，堿性位于N-末端，酸性位于C-末端。Chmp1A在哺乳動物中是高度保守的，開放閱讀框(ORF)全長591個核苷酸，編碼197個氨基酸。Chmp1A在囊泡和多泡體(MVB)的形成過程中起著關(guān)鍵作用，且與早期和晚期內(nèi)體膜結(jié)構(gòu)具有直接相關(guān)性。

Stauffer等將不同種類細(xì)胞的胞質(zhì)和核基質(zhì)進行分離，然后通過western?blot進行分析發(fā)現(xiàn)，在胞質(zhì)和核基質(zhì)中均有Chmp1A表達，且在核基質(zhì)中出現(xiàn)32kD和34kD兩種蛋白表達形式，而在胞質(zhì)中只有32kD一種形式，在細(xì)胞有絲分裂的各個階段Chmp1A在胞質(zhì)和核基質(zhì)中濃度的比率基本不變。但通過免疫細(xì)胞化學(xué)和共聚焦顯微鏡實時檢測發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞分裂早期Chmp1A主要分布于胞質(zhì)，而在分裂末期主要聚集在核基質(zhì)，該現(xiàn)象可能由于Chmp1A有一個抗原表位通常被屏蔽，以至于抗體不能有效識別。

有研究表明，Chmp1A可能是一種PcG蛋白，影響染色體結(jié)構(gòu)和細(xì)胞周期。PcG蛋白是一組通過染色質(zhì)修飾調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制子，從生化和功能上它可以分成兩個主要的核心蛋白復(fù)合體PRC1(Polycomb?repressive?complex?1)和PRC2(Polycomb?repressive?complex?2)，生化和遺傳研究顯示PcG蛋白的沉默功能是通過對染色體結(jié)構(gòu)的修飾實現(xiàn)的。PRC1蛋白由M33/HPC1、Bmi-1、Mel-18、HPH1、HPH2、HPH3、HPC2、HPC3、SCMH1、RING1A和RING1B組成一個約1MDa的異質(zhì)性多亞基蛋白復(fù)合體，PRC2蛋白由ESC(Extra?Sex?Combs)和Ez(Enhancer?of?Zeste)組成一個約600kDa核心復(fù)合體。PcG蛋白不僅控制個體正確的發(fā)育模式，而且與細(xì)胞的增殖、分化和腫瘤發(fā)生有關(guān)。在前列腺癌、非小細(xì)胞性肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中PcG蛋白表達均失調(diào)，且Mel-18已經(jīng)被證實是乳腺癌腫瘤抑制基因。通過酵母雙雜交篩選，Chmp1A是一個與pcl(PcG樣蛋白，可與多個PcG蛋白結(jié)合)結(jié)合的蛋白，激光掃描共聚焦顯示，Chmp1A并不與染色體直接作用，而是與亞核結(jié)構(gòu)的外部結(jié)合，通過募集已知的PcG蛋白Bmi-1，使組蛋白磷酸化和乙?；?，進而濃縮染色質(zhì)，Chmp1A與亞核結(jié)構(gòu)形成的復(fù)合物可以在一定程度上抵抗DNA酶的降解。爪蟾胚胎注射RNA顯示，Chmp1A有著與PcG蛋白M33和Bmi-1相同的生物學(xué)效應(yīng)，均能抑制En-2and?Rx2A的表達，并能破壞正常前神經(jīng)的生長發(fā)育。

Chmp1A與囊泡轉(zhuǎn)運有密切關(guān)系。囊泡轉(zhuǎn)運在生物合成、降解和細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中起著連接細(xì)胞器和運輸?shù)淖饔?。?nèi)體在囊泡轉(zhuǎn)運過程中起著連接高爾基體、溶酶體和細(xì)胞膜的作用。囊泡以出芽的方式從內(nèi)體中釋放蛋白到細(xì)胞表面或高爾基體，囊泡內(nèi)的蛋白是被降解還是參與再循環(huán)取決于內(nèi)體膜向內(nèi)或向外出芽的競爭，如果內(nèi)體膜向內(nèi)凹陷形成MVB，MVB會將蛋白和水解酶運送到溶酶體中。囊泡分選蛋白(Vps)作用是使羧肽酶Y(CPY)轉(zhuǎn)運到溶酶體中，E類Vps作用是使羧肽酶S(CPS)轉(zhuǎn)運到溶酶體中。研究發(fā)現(xiàn)，敲除Chmp1A的細(xì)胞溶酶體中未檢測到CPY和CPS，而CPY和CPS均聚集在溶酶體膜表面，細(xì)胞中重新轉(zhuǎn)染Chmp1A質(zhì)粒后CPY和CPS也被導(dǎo)入溶酶體內(nèi)部，暗示Chmp1A在囊泡轉(zhuǎn)運過程中起重要作用。

Chmp1A可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。超表達Chmp1A的細(xì)胞系誘導(dǎo)表達24小時后，細(xì)胞分裂系數(shù)減小了十倍，能進行DNA復(fù)制的細(xì)胞比例降低了四倍，TUNEL實驗結(jié)果顯示該情況并不是細(xì)胞凋亡的結(jié)果；流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，超表達Chmp1A的細(xì)胞系處于S期的細(xì)胞有了明顯的增加(約占總細(xì)胞的80％左右)，且大多處于S期末期。Chmp1A使細(xì)胞生長停滯于S期和減弱細(xì)胞DNA復(fù)制活性的能力暗示其可能是潛在的腫瘤抑制因子。