[發明專利]一種玉米農華101種子純度檢測方法

無效

• 申請號: 201210189795.6
• 申請日: 2012-06-08
• 公開（公告）號: CN102788830A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 王璽;蘭星
• 申請（專利權）人: 北京金色農華種業科技有限公司
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于種子質量檢測領域，具體涉及一種玉米農華101種子純度檢測方法。

背景技術

聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGE(Polyacrylamide?gel?electrophoresis)，是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的一種電泳技術。聚丙烯酰胺凝膠為網狀結構，具有分子篩效應，用于分離蛋白質和寡糖核苷酸。在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的過程中，蛋白質能夠保持完整狀態，并依據蛋白質的分子量大小、蛋白質的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。

從玉米種子中提取的蛋白質在凝膠的分子篩效應、樣品的濃縮效應和電泳分離的電荷效應下得到良好的分離，通過顯色顯示蛋白質譜帶類型。不同品種因遺傳基礎不同，因而形成的蛋白質種類和數量不同，電泳分離后所形成的蛋白質譜帶類型也不同，并可作為品種指紋(Fingerprint)，即鑒定品種的生化性狀，利用品種指紋來分析單粒種子鑒定品種純度。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供一種玉米農華101種子純度檢測方法。

本發明提供的方法，包括如下步驟：

1)種子蛋白質提取：取單粒種子粉碎后，加入0.6-0.8ml蛋白提取液，搖勻，蓋好后在室溫放置20-40min，加樣前4000-8000rpm離心10-20min；

2)取步驟1)離心后的上清，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；

3)電泳后將膠板進行染色，按農華101的標準譜帶鑒別出異品種種子粒數，計算品種純度，

其中，所述的蛋白提取液為含有質量分數為15-20％和體積分數為15-20％的冰醋酸的水溶液。

其中，聚丙烯酰胺凝膠電泳的電極緩沖液為含有體積分數為0.3-0.5％冰醋酸和質量分數為0.03-0.05％甘氨酸的水溶液。

其中，聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離膠按如下方式制備：

1)制備制膠液：

1號：90g丙烯酰胺+3g甲叉雙丙烯酰胺加水溶解并定容至500ml；

2號：60g脲加水溶解并定容至200ml；

3號：48ml?1M氫氧化鉀+17.2ml冰乙酸加無離子水溶解并定容至100ml；

5號：四甲基乙二胺的原液；

6號：10g過硫酸銨加水溶解并定容至100ml；

2)灌分離膠：

依次取1號22.5ml、2號5ml、3號3.75ml、6號1.6ml、5號0.2ml混合搖勻后，灌入膠室至距頂端2-3cm為止，避免形成氣泡，膠聚合后，用濾紙或注射器吸去析出的水。

其中，聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠按如下方式制備：

1)制備制膠液：

1號：90g丙烯酰胺+3g甲叉雙丙烯酰胺加水溶解并定容至500ml；

2號：60g脲加水溶解并定容至200ml；

4號：48ml?1M氫氧化鉀+2.9ml冰乙酸加水溶解并定容至100ml。

5號：四甲基乙二胺的原液；

6號：10g過硫酸銨加水溶解并定容至100ml；

2)灌濃縮膠：

依次取1號3ml、2號2ml、4號5ml、6號0.3ml、5號0.04ml迅速搖勻后灌入分離膠上面，并立即插入樣品梳，待濃縮膠聚合后拔出樣品梳，用吸去各凹槽中多余的水分。

其中，聚丙烯酰胺凝膠電泳中，每個樣品加樣25-30μl。

本發明具有以下有益效果：

1)快速、簡便

農華101傳統純度檢測方法為SSR檢測，該方法樣品采用人工挖胚，還要進行多對引物篩選，從提取到電泳染色操作全過程復雜繁瑣，一個工作日(按8小時計算)至多能夠完成7個樣品的純度檢驗。而本發明方法樣品使用單粒樣品粉碎進行研磨，采用比例藥劑配方，提取至電泳染色步驟簡單，可輕松出具12個樣品的純度結果，檢驗速度幾乎翻倍。

2)電泳譜帶清晰、可長期保存

采用SSR標記的檢測需在紫外凝膠成像系統中觀測，清晰度很難調節，只能獲得電泳圖片，膠片無法保存，而且膠片中殘留EB，毒性大，不利環保。而本方法電泳譜帶在膠片上即可清晰顯現，無劇毒，易于觀測將其裝去自封袋放入冰箱或放入水中加幾滴醋酸都可長期保存。

3)節約成本

經計算，本發明方法所需儀器設備價格不到SSR檢測的1/10，所用藥品價錢也很便宜，檢驗相同樣品量成本至少降低一半左右。

總之，本發明方法是對玉米雜交種農華101純度檢驗的一項技術性突破，適應范圍廣，節約效果顯著，有很好的應用推廣價值。

附圖說明