[發(fā)明專利]多肽PyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl的合成

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210189481.6
• 申請(qǐng)日: 2012-06-08
• 公開（公告）號(hào): CN102690325A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝永華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海太陽生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C07K5/093
• 分類號(hào): C07K5/093;C07K1/06
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 馮瓊;李玉秋

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及多肽合成領(lǐng)域，特別涉及一種多肽發(fā)色底物PyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl的合成方法。

背景技術(shù)

PyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl（S-2366）的多肽部分的結(jié)構(gòu)為三肽加發(fā)色基團(tuán)，是一種血漿活性蛋白C（簡稱APC）和凝血因子XI的發(fā)色底物，該底物可用于血漿活性蛋白C活性的定量檢測，在科研和臨床上有著廣泛的應(yīng)用。

現(xiàn)有文獻(xiàn)未見有關(guān)S-2366合成的報(bào)道，其他相關(guān)發(fā)色底物的合成文獻(xiàn)中，肽鍵的縮合通常使用疊氮法、活性酯法、混合酸酐法等方法，反應(yīng)操作較為復(fù)雜，收率不高。

精氨酸的胍基具有強(qiáng)親核性和堿性，在多肽合成中須加以保護(hù)，常用的保護(hù)方法有硝基、芐氧甲?；Ｗo(hù)以及現(xiàn)在固相合成中使用較多的苯磺酰基類（如Pbf）保護(hù)等。這些保護(hù)基團(tuán)在脫保護(hù)后都需要對(duì)底物肽進(jìn)行鹽類型的轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)變?yōu)榭蒲屑芭R床上使用的鹽酸鹽或者醋酸鹽的形式。目前轉(zhuǎn)鹽一般是通過過離子交換柱的方式，需要價(jià)格昂貴的離子交換介質(zhì)以及很長的過柱時(shí)間，尤其是當(dāng)制備量較大時(shí)更是如此。

對(duì)硝基苯胺（pNA），由于硝基的強(qiáng)吸電子作用，親核性非常差，與精氨酸縮合時(shí)，一般的酰胺鍵合成方法效果很差，收率很低。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種高收率的PyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl的合成方法，該方法工藝簡單、成本低，適合大批量生產(chǎn)。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用了如下方案：

PyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl的合成方法，包括以下步驟：

（1）以三氯氧磷為縮合劑，將氨基與胍基均帶有保護(hù)基的精氨酸與對(duì)硝基苯胺縮合；所述精氨酸的胍基保護(hù)基為雙叔丁氧羰基；

（2）脫除步驟（1）所得產(chǎn)物的氨基保護(hù)基，獲得中間體1；

（3）將焦谷氨酸與羧基帶保護(hù)基的脯氨酸縮合；

（4）脫除步驟（3）所得產(chǎn)物的羧基保護(hù)基，獲得中間體2；

（5）將所述中間體1和中間體2進(jìn)行縮合；

（6）以HCl或HCl和乙酸乙酯的混合物為脫保護(hù)基試劑，脫除步驟（5）所得產(chǎn)物的胍基保護(hù)基，獲得PyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl。

上述合成方法中，所述精氨酸的氨基保護(hù)基為9-芴甲氧羰基；當(dāng)以9-芴甲氧羰基為氨基保護(hù)基時(shí)，步驟（2）所述氨基保護(hù)基的脫除試劑為堿。

所述脯氨酸的羧基保護(hù)基為酯，優(yōu)選叔丁酯；當(dāng)以酯（包括叔丁酯）為脯氨酸的羧基保護(hù)基時(shí)，步驟（4）所述羧基保護(hù)基的脫除試劑為酸。

上述合成方法中，步驟（1）的反應(yīng)溫度為-10℃～0℃，優(yōu)選-5℃。

步驟（1）的反應(yīng)溶劑為堿性有機(jī)溶劑，優(yōu)選反應(yīng)溶劑為吡啶。

上述合成方法中，步驟（3）和步驟（5）所述縮合反應(yīng)采用碳二亞胺為縮合劑，所述碳二亞胺選自N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺、N,N-二異丙基碳二亞胺、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽，優(yōu)選1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽。

當(dāng)采用1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽為縮合劑時(shí)，在反應(yīng)時(shí)加入HOBt，有助于減少副反應(yīng)的發(fā)生，有效提高縮合效率。

本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施路線如下：

本發(fā)明所述合成方法，具有以下特點(diǎn)：

（1）精氨酸與發(fā)色基團(tuán)（對(duì)硝基苯胺）的縮合效率高

對(duì)硝基苯胺，由于硝基的強(qiáng)吸電子作用，親核性非常差，一般的酰胺鍵合成方法很難縮合成功。本發(fā)明采用三氯氧磷作為縮合劑，在低溫下活化精氨酸羧基，然后與對(duì)硝基苯胺發(fā)生氨解反應(yīng)，15-30分鐘內(nèi)即能反應(yīng)完全，收率在80%以上。溶劑吡啶能夠催化親核進(jìn)攻反應(yīng)，提高反應(yīng)效率，同時(shí)能夠保護(hù)酸不穩(wěn)定基團(tuán)（如Boc）。

（2）肽鍵縮合效率高

本發(fā)明的肽鍵縮合優(yōu)選碳二亞胺型縮合試劑，具有反應(yīng)條件溫和、后處理簡單、收率較高的特點(diǎn)。更優(yōu)選1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽為縮合試劑，其為水溶性，在反應(yīng)時(shí)加入HOBt，能夠?qū)⒏狈磻?yīng)控制在很低的范圍，有效提高縮合效率。

（3）精氨酸胍基保護(hù)基的脫保護(hù)工藝簡單，成本低

本發(fā)明采用雙叔丁氧羰基（bis-Boc）為精氨酸的胍基保護(hù)基團(tuán)，在反應(yīng)的最后一步，使用HCl或HCl和乙酸乙酯的混合物進(jìn)行脫保護(hù)，脫保護(hù)反應(yīng)溫度較低，發(fā)色基團(tuán)不受影響，產(chǎn)物直接形成底物肽的鹽酸鹽，省去轉(zhuǎn)鹽步驟，節(jié)省了制備時(shí)間和成本。