[發明專利]雙酶法制備分子量可控的藥用右旋糖酐

無效

• 申請號: 201210189437.5
• 申請日: 2012-06-10
• 公開（公告）號: CN102676615A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 張洪斌;甘微葦;吳定濤;胡雪芹
• 申請（專利權）人: 合肥工業大學
• 主分類號: C12P19/18
• 分類號: C12P19/18;C12P19/16
• 代理公司: 安徽省合肥新安專利代理有限責任公司 34101
• 代理人: 何梅生

技術領域

本發明涉及生物制藥與酶工程領域，具體地說是采用右旋糖酐蔗糖酶及右旋糖酐酶聯合制備分子量可控的藥用右旋糖酐的工藝。

背景技術

右旋糖酐(Dextran)?是若干葡聚糖脫水形成的聚合物，主要由葡萄糖α-1,?6糖苷鍵連接而成，由腸膜狀明串菌株(Leuconstoc?mesenteriodes)?產生的右旋糖酐蔗糖酶（Dextransucrase；E.C.2.4.1.5）合成的右旋糖酐含有95%的α-1,?6糖苷鍵，同時含有少量其它糖苷鍵的分支結構。因其具有安全、無毒等多種優點，已被廣泛應用于醫藥、工業、食品等多個領域。高分子右旋糖酐可以被用來作為藥物載體，以及常用的凝膠色譜填料。臨床上常用的有中分子右旋糖酐70、右旋糖酐40及右旋糖酐20，主要用作血漿代用品，用于出血性休克、創傷性休克及燒傷性休克等。重均分子量6-8?kDa的右旋糖酐常被用于制成右旋糖酐鐵，用于治療嚴重的貧血癥。重均分子量低于5?kDa的右旋糖酐常被硫酸化，用于抗血栓。小分子右旋糖酐1（Dextran?1,?M_W?1000?Da）近來被發現，可以避免由于右旋糖酐70及40而引起的人體自身免疫的變態反應。分子量更小的低聚異麥芽糖則被用于益生元。

目前國內多采用發酵方法制備高分子右旋糖酐，再利用鹽酸水解得到不同分子量的藥用右旋糖酐，由于生產的右旋糖酐含有大量的氯化物嚴重影響了右旋糖酐的質量和品質，在臨床使用過程中常出現過敏反應，可引起皮膚反應、嚴重的呼吸和循環衰竭，甚至導致死亡。同時由于是酸催化水解，水解過程無序，得到的產品分子量分布不集中，影響產品的質量。另外，由于利用鹽酸水解需要高溫高酸等惡劣條件，不利于環保、低碳。而采用右旋糖酐蔗糖酶及右旋糖酐酶酶法制備藥用級右旋糖酐，就能減少氯化物對產品質量的影響，同時由于酶對底物的特異性水解，能得到分子量分布集中的高品質右旋糖酐，產品達到高產率。此外，酶催化降解反應條件溫和、能耗低，從而實現了中、小分子量多糖生產工藝的綠色、環保、低碳的目標。目前國外已有學者直接采用分別產右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶的菌株發酵制備藥用右旋糖酐，但是由于直接發酵，菌株產生的代謝物種類繁雜，不利于產品的分離純化，同時由于產率低，不利于產業化生產。另外也有學者采用右旋糖酐蔗糖酶及右旋糖酐酶雙酶聯合制備藥用糖酐，但是由于產率較低（36%），從而不利于產業化生產。

發明內容

本發明為了避免現有技術存在的不足之處，提供一種采用右旋糖酐蔗糖酶及右旋糖酐酶雙酶聯合制備分子量可控的藥用右旋糖酐的方法，該方法不僅綠色、環保、低成本、簡便；而且使制備獲得的右旋糖酐分子量可控。

本發明解決技術問題采用如下方案：

雙酶法制備分子量可控的藥用右旋糖酐，該方法按如下步驟進行：

（1）右旋糖酐蔗糖酶合成高分子右旋糖酐，

采用pH?5.4?0.02?mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液配制終體積濃度12%的蔗糖溶液1000?mL，所述緩沖液中添加0.05g/L?CaCl₂；將配置好的蔗糖溶液置于25℃保溫10?min后，加入右旋糖酐蔗糖酶使其終濃度為2?IU/mL，置于25℃恒溫、120r/min反應4小時，再置于25℃條件下保溫20小時；然后終止右旋糖酐蔗糖酶的催化反應，將反應液用于下一步右旋糖酐酶的催化水解；

所述右旋糖酐蔗糖酶的一個酶活IU是指，以pH5.4的醋酸-醋酸鈣緩沖液配制終體積濃度為10%的蔗糖溶液為底物；所述緩沖液中含醋酸鈣?0.05?g/L、冰醋酸0.02?mol/L；25℃條件下，每毫升底物反應液中每小時催化蔗糖產生0.1?mg果糖所需要的酶量；

（2）右旋糖酐酶催化水解高分子右旋糖酐

向步驟1）經右旋糖酐蔗糖酶催化合成的反應液中加入右旋糖酐酶使其終濃度為0.23?U/mL，置于35℃條件下攪拌反應160min-180?min，然后終止酶促反應；

所述右旋糖酐酶的一個酶活U是指，以pH?5.0的醋酸鹽緩沖液配制的終體積濃度為3%的重均分子量為70?kDa的右旋糖酐溶液為底物，在35℃條件下，每分鐘產生1μmol還原糖所需要的右旋糖酐酶量；

（3）去除雜質

將上述步驟2）經右旋糖酐酶催化水解的反應液置于80℃保溫3小時，隨后采用多層紗布過濾雜質，重復過濾兩次，隨后采用中速定性濾紙過濾上清液；然后再將上述過濾后的上清液加熱煮沸15?min，待上清液冷卻后，再利用中速定性濾紙過濾去除雜質，清澈無色的濾液用于下一步乙醇分級醇沉；

（4）乙醇分級醇沉及真空干燥