[發(fā)明專利]雙酶法制備分子量可控的藥用右旋糖酐

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210189437.5
• 申請日: 2012-06-10
• 公開（公告）號: CN102676615A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張洪斌;甘微葦;吳定濤;胡雪芹
• 申請（專利權(quán)）人: 合肥工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12P19/18
• 分類號: C12P19/18;C12P19/16
• 代理公司: 安徽省合肥新安專利代理有限責(zé)任公司 34101
• 代理人: 何梅生

1.雙酶法制備分子量可控的藥用右旋糖酐，其特征在于，該方法按如下步驟進行：

（1）右旋糖酐蔗糖酶合成高分子右旋糖酐，

采用pH?5.4?0.02?mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液配制終體積濃度12%的蔗糖溶液1000?mL，所述緩沖液中添加0.05g/L?CaCl₂；將配置好的蔗糖溶液置于25℃保溫10?min后，加入右旋糖酐蔗糖酶使其終濃度為2?IU/mL，置于25℃恒溫、120r/min反應(yīng)4小時，再置于25℃條件下保溫20小時；然后終止右旋糖酐蔗糖酶的催化反應(yīng)，將反應(yīng)液用于下一步右旋糖酐酶的催化水解；

所述右旋糖酐蔗糖酶的一個酶活I(lǐng)U是指，以pH5.4的醋酸-醋酸鈣緩沖液配制終體積濃度為10%的蔗糖溶液為底物；所述緩沖液中含醋酸鈣?0.05?g/L、冰醋酸0.02?mol/L；25℃條件下，每毫升底物反應(yīng)液中每小時催化蔗糖產(chǎn)生0.1?mg果糖所需要的酶量；

（2）右旋糖酐酶催化水解高分子右旋糖酐

向步驟1）經(jīng)右旋糖酐蔗糖酶催化合成的反應(yīng)液中加入右旋糖酐酶使其終濃度為0.23?U/mL，置于35℃條件下攪拌反應(yīng)160min-180?min，然后終止酶促反應(yīng)；

所述右旋糖酐酶的一個酶活U是指，以pH?5.0的醋酸鹽緩沖液配制的終體積濃度為3%的重均分子量為70?kDa的右旋糖酐溶液為底物，在35℃條件下，每分鐘產(chǎn)生1μmol還原糖所需要的右旋糖酐酶量；

（3）去除雜質(zhì)

將上述步驟2）經(jīng)右旋糖酐酶催化水解的反應(yīng)液置于80℃保溫3小時，隨后采用多層紗布過濾雜質(zhì)，重復(fù)過濾兩次，隨后采用中速定性濾紙過濾上清液；然后再將上述過濾后的上清液加熱煮沸15?min，待上清液冷卻后，再利用中速定性濾紙過濾去除雜質(zhì)，清澈無色的濾液用于下一步乙醇分級醇沉；

（4）乙醇分級醇沉及真空干燥

采用4級劃分，一級劃分乙醇體積濃度為39%，在攪拌裝置下，向步驟（3）所得濾液中緩慢加入體積濃度95%乙醇，定時測定濾液中乙醇體積濃度，當(dāng)乙醇體積濃度達到39%時停止醇沉，將濾液置于40度保溫22小時，然后倒出上清液，再向沉淀中加入適量乙醇取出大分子雜質(zhì)；二級劃分乙醇體積濃度為43%，向一級劃分后的上清液中緩慢加入體積濃度95%的乙醇，具體操作同上，待濾液乙醇體積濃度達43%時，停止醇沉，將醇沉好的濾液置于34度保溫22小時，然后倒出上清液，再向沉淀中加入乙醇獲得右旋糖酐70產(chǎn)品；三級劃分乙醇濃度為47%，向二級劃分后的上清液中緩慢加入體積濃度95%的乙醇，具體操作同上，待濾液乙醇體積濃度達47%時，停止醇沉，將醇沉好的慮液置于40度保溫12小時，倒出上清液，再向沉淀中加入乙醇獲得右旋糖酐40產(chǎn)品；四級劃分乙醇濃度為57%，向三級劃分后的上清液中緩慢加入體積濃度95%的乙醇，具體操作同上，待濾液乙醇體積濃度達57%時，停止醇沉，將醇沉好的慮液置于常溫，2小時后，再加入乙醇獲得右旋糖酐20產(chǎn)品；

將上述乙醇劃分所得到的產(chǎn)品分別置于80℃真空干燥箱中干燥4小時，去除產(chǎn)品中殘留的乙醇及水分，即得到相應(yīng)的右旋糖酐產(chǎn)品。