[發明專利]構建核酸庫的方法、試劑及試劑盒

無效

• 申請號: 201210188750.7
• 申請日: 2012-07-11
• 公開（公告）號: CN102703432A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 王焱
• 申請（專利權）人: 煙臺博諾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明為建立核酸庫提供了方法、試劑及試劑盒。特別是在建庫過程中使用了轉座酶、核酸酶和連接酶。

背景技術

怎樣有效和高效地用各種不同材料的DNA和RNA來建立文庫，這對第二代測序（NGS）的研究人員和操作人員來說是一個挑戰。現有的技術，包括通過物理手段：超聲波法或霧化法來打斷雙鏈DNA，這需要較大量的起始材料。這個過程是漫長的，很難以高通量的方式進行。NEB的科學家最近開發使用FRAGMENTASE，在離心管中進行酶反應，這和物理打斷相比是一個不錯的選擇，但仍然需要大量的起始材料。EPICENTRE公司開發了NEXTERANEXTERA試劑，從而使研究人員能夠在2小時內完成建庫過程，并且起始材料只要50NG。然而，它需要的測序引物與現有的測序平臺的測序引物不兼容，這是讓許多潛在用戶感到失望的一點。

第二代測序建庫領域面臨的另一個挑戰是，測序平臺發展非常快，新測序儀的研發只需要幾年的時間，更新換代很快。第三代測序技術也有可能在不久的將來會對第二代技術進行挑戰或替換。新技術和設備的快速發展，為那些只需進行很小的調整，就能將建庫技術應用于新的儀器和技術平臺的建庫產品帶來了技術和商業上的競爭力，也為那些企業帶來了巨大的商業機會。

本發明的目的是建立一個文庫的制備方法，可用于所有現有的和即將推出的極少改動的新測序儀，可以用于高通量，并適用于機器操作，只需要較少的起始材料，即可產生滿意的測序結果。

發明內容

本發明提供了隨機斷裂并同時標記DNA片段的方法，組分和試劑盒。特別是，本發明采用體外轉座，用核酸酶和連接酶來標記核酸庫以適合下一代測序應用。

在一些實例中，本發明方法為隨機斷裂并同時標記DNA片段提供了方法，適用的DNA片段可以是純化的基因組DNA，雙鏈的CDNA，PCR后的雙鏈DNA產物，或是滾環復制產生的大片段DNA，這些DNA的來源可以是人，動物，植物或者微生物。

其中包括：A）將轉座酶和轉座子末端序列（TRANSPOSONE?END?－TE）與雙鏈目標DNA混合，在轉座酶的催化作用下，雙鏈的轉座子隨機插入目標DNA序列中。轉座酶可以包括：（TN5,?TN3,?TN7,?TN8，TN9，TN10，TN11,?TN2,?TN4,?TN6以及它們的各種突變版本）。在轉座子插入過程中，轉座子末端的一條單鏈以共價鍵連接在DNA片斷的5'端，轉座子末端的第二條鏈與DNA片斷不相連，但是在退火條件下，仍以雙鏈形式存在。在第二鏈的轉座末端和DNA片段3'端之間有9個堿基的空位。由此就產生了隨機斷裂的，并被（TE）標記的DNA片段。這些片段從5'至3'，始于雙鏈轉座子末端序列，繼而是9個堿基對的單鏈DNA序列，然后是雙鏈目標DNA片段，9BP的單鏈DNA序列和雙鏈轉座子末端；B）從轉座子末端序列（TE）標記的DNA片斷中去除雙鏈轉座子末端序列（TE），生成未標記的DNA片段；C）在未標記的DNA片斷上連接需要的DNA標記，產生一個新的有標記的DNA片段。

在一些實例中，轉座子可以包括：（TN5）。

在一些實例中，轉座子末端的第二條鏈，是游離的，并不和目標DNA序列共價連接。在高溫條件下，轉座子末端序列（TE）標記的DNA片段被分離，而目標DNA部分保持不變。在移除轉座子末端的第二條鏈后，可以使用一些特定的單鏈DNA核酸酶來移除剩下的轉座子的第一條鏈和9個堿基對的單鏈DNA。

在另外一些實例中，用DNA聚合酶來補平5'端，在3'端加上A尾。適用于這一應用的聚合酶不僅僅局限于DNA聚合酶和TAQ?DNA聚合酶，大片段DNA聚合酶Ⅰ（KLENOW片段）也可以使用。KLENOW片段是去除了3'到5'外切酶活性的DNA聚合酶Ⅰ。而用DNA?聚合酶補平5'端，形成平末端（而不是A尾），則要使用具有3'到5'外切酶活性的DNA聚合酶，如T7?DNA聚合酶，T4?DNA聚合酶，大片斷DNA聚合酶Ⅰ等。