[發(fā)明專利]適用于大規(guī)模基因型鑒定的牛奶中基因組DNA的提取方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210188448.1
• 申請日: 2012-06-08
• 公開（公告）號(hào): CN102719426A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉永峰;楊永芳;李景景
• 申請（專利權(quán)）人: 陜西師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 西安恒泰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 61216
• 代理人: 李鄭建

1.一種適用于大規(guī)模基因型鑒定的牛奶中基因組DNA的提取方法，其特征在于，包括下列步驟：

步驟一，離心管準(zhǔn)備：采用15mL離心管，在高壓滅菌鍋中進(jìn)行滅菌，備用；

步驟二，牛奶采集：采集新鮮牛奶10mL-13mL至離心管中，每個(gè)管中加入2滴重鉻酸鉀，冰袋帶回，放置-20℃保存；

步驟三，牛奶體細(xì)胞分離與富集：將上述低溫保存的奶樣于4℃解凍，在2500r/min，4℃下離心30min；用小勺刮去離心管上層的乳脂，用吸管將中間層的乳蛋白去掉，保留最底部的一層沉淀；向離心管底部加入600μL磷酸緩沖液（PBS），將底部沉淀捶打懸浮并轉(zhuǎn)移至1.5mL的離心管中，3500r/min常溫離心10min，棄去上層液體，保留底部沉淀；再向底部沉淀加60μL飛乳化劑、540μL的PBS，用振蕩器振蕩至沉淀完全懸浮，40℃恒溫水浴處理10min脫去體細(xì)胞周圍的乳脂，3500r/min，常溫離心10min，棄上清，加PBS?500μL懸浮沉淀，于12000r/min低溫離心10min使體細(xì)胞沉淀富集，棄上清；

步驟四，牛奶體細(xì)胞消化：向體細(xì)胞沉淀中加入350μL的DNA提取緩沖液，50μL的SDS，10μL的蛋白酶K，在56℃下水浴消化過夜；

步驟五，SDS苯酚法提取DNA：首先，向消化產(chǎn)物中加等體積的Tris飽和酚溶液，來回顛倒10min，12000r/min，低溫離心10min，得到上清液；將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)1.5mL離心管中，加入等體積的酚、氯仿和異戊醇混合物，其中，酚、氯仿和異戊醇按體積比25︰24︰1配制；來回顛倒10min，使沉淀溶解，12000r/min，離心10min，得到上清液；再將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)1.5mL離心管中，加入等體積的氯仿和異戊醇混合物，其中，氯仿和異戊醇體積比為24︰1，來回顛倒10min，使沉淀溶解，12000r/min，離心10min，得到上清液；

步驟六，核酸沉淀：將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)1.5mL的離心管，加入2倍體積的-20℃冰無水乙醇沉淀，輕輕振搖，-20℃條件下靜置30min，12000r/min離心10min，棄去上層乙醇；底部沉淀用質(zhì)量濃度為70%的-20℃冰乙醇洗滌，12000r/min，低溫離心10min，小心去除上層乙醇，揮發(fā)乙醇，加入25μL的TE溶解DNA，-4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟七，DNA質(zhì)量檢測：用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測定，80%以上所獲得基因組DNA濃度值處于12μg/μL-45μg/μL之間，純度OD_260/280值處于1.65-1.75之間，且瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行條帶檢測條帶整齊一致，完整性好，沒有明顯拖尾及彌散現(xiàn)象；

步驟八，特異性基因的選擇：隨機(jī)選擇牛的特異性功能基因作為研究對象，并在GenBank中查找該基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物；

步驟九，PCR擴(kuò)增及測序：選擇合適的PCR體系和反應(yīng)條件，開展PCR擴(kuò)增，并用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行回收、純化，送往測序公司進(jìn)行測序；

步驟十，基因分型鑒定：測序所得基因序列，可進(jìn)行大規(guī)模基因分型鑒定，繼而開展后續(xù)的分子生物學(xué)分析。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所提取的DNA用于500bp以內(nèi)的短片段序列擴(kuò)增，或者用于500bp以上的片段序列擴(kuò)增，或者用于1000bp以上的長片段序列擴(kuò)增。