[發(fā)明專(zhuān)利]適用于大規(guī)?；蛐丸b定的牛奶中基因組DNA的提取方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210188448.1
• 申請(qǐng)日: 2012-06-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102719426A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉永峰;楊永芳;李景景
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 陜西師范大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 西安恒泰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 61216
• 代理人: 李鄭建

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種適用于大規(guī)?；蛐丸b定的牛奶中基因組DNA的提取方法，該方法能夠從10mL-13mL鮮奶中提取質(zhì)量完整、濃度及純度較好的基因組DNA，以該DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以擴(kuò)增出1000bp以上的長(zhǎng)片段?；蚪MDNA序列，進(jìn)而開(kāi)展基因型鑒定和分子生物學(xué)分析。

背景技術(shù)

近幾年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)已成為奶產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)和分子營(yíng)養(yǎng)研究中的有利工具。獲得高質(zhì)量基因組DNA是進(jìn)行食品營(yíng)養(yǎng)功能鑒定、食品可溯性、奶牛群體遺傳變異、分子標(biāo)記輔助選擇育種、親子鑒定、DNA?Southern雜交等后續(xù)分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。目前，分離奶牛DNA的材料主要包括血液、肌肉組織、臟器組織等，血液的收集主要采用奶牛頸靜脈采血，組織的收集采用剪耳法。生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，這些方式都會(huì)對(duì)奶牛產(chǎn)生應(yīng)激，影響奶牛生產(chǎn)水平，也有一定的技術(shù)難度，需要專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行操作，而且對(duì)于奶牛場(chǎng)來(lái)說(shuō)也是一筆不小的損失，采樣阻力很大。因此，尋求更為適宜的材料勢(shì)在必行。

牛奶中的體細(xì)胞通常由多形核嗜中性白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和少量的乳腺組織上皮細(xì)胞等組成。在正常生理狀況下，每毫升牛奶約有2萬(wàn)-20萬(wàn)個(gè)體細(xì)胞。體細(xì)胞數(shù)受年齡和胎次、泌乳期階段、季節(jié)、機(jī)體應(yīng)激、個(gè)體特性以及擠奶操作等因素的影響。奶牛具有獨(dú)特的防御體系，當(dāng)奶牛的泌乳系統(tǒng)受不同種類(lèi)細(xì)菌的侵襲而發(fā)生感染及損傷時(shí)，通過(guò)機(jī)體的免疫機(jī)制承擔(dān)排除感染與修復(fù)受破壞組織任務(wù)的白細(xì)胞就會(huì)在此集聚。隨之該乳腺組織分泌的乳汁中體細(xì)胞數(shù)即大幅度上升至30萬(wàn)-1000萬(wàn)。血液中的細(xì)胞數(shù)也會(huì)隨著感染度不同而不同，一般在700萬(wàn)-1000萬(wàn)范圍內(nèi)。在相同體積下，血液中最少體細(xì)胞個(gè)數(shù)約為牛奶中最少體細(xì)胞個(gè)數(shù)的350倍，因此從牛奶中提取DNA相對(duì)困難一些。經(jīng)前人研究顯示，平均每毫升牛奶的體細(xì)胞數(shù)達(dá)到30萬(wàn)左右，即基本達(dá)到了提取DNA的細(xì)胞濃度，從牛奶中提取DNA理論上是可行的。

近年來(lái)，一些國(guó)內(nèi)外少數(shù)研究者開(kāi)始探究從牛奶中提取基因組DNA的方法，田雨等將分離牛奶體細(xì)胞技術(shù)與高溫裂解法結(jié)合提取DNA，張軍偉等進(jìn)行了該方法的優(yōu)化，Murphy等也運(yùn)用苯酚/氯仿法提取出了DNA。但是，這些方法取樣量較大，都在50mL以上；而且提取的DNA只能進(jìn)行500bp以內(nèi)的小片段基因序列的PCR擴(kuò)增，不適合大規(guī)模基因型的鑒定以及分子生物學(xué)分析。

綜上所述，優(yōu)化建立適于大規(guī)?；蛐丸b定的一種新型、簡(jiǎn)便的基因組DNA提取方法，是申請(qǐng)人研究的課題之一。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于，提供一種適用于大規(guī)?；蛐丸b定的牛奶中基因組DNA的提取方法，該方法能夠在10mL-13mL鮮奶中提取質(zhì)量完整、濃度及純度較好的基因組DNA，以該DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以擴(kuò)增出1000bp以上的長(zhǎng)片段牛基因組DNA序列，進(jìn)而開(kāi)展基因型鑒定和分子生物學(xué)分析。

為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

一種適用于大規(guī)模基因型鑒定的牛奶中基因組DNA的提取方法，其特征在于，該方法按如下步驟進(jìn)行：

步驟一，離心管準(zhǔn)備：選購(gòu)15mL離心管，在高壓滅菌鍋中進(jìn)行滅菌，備用。

步驟二、牛奶采集：采集新鮮牛奶10mL-13mL至離心管中，每個(gè)管中加入2滴重鉻酸鉀，冰袋帶回，放置-20℃保存。

步驟三，牛奶體細(xì)胞分離與富集：將上述低溫保存的奶樣于4℃解凍，在2500r/min，4℃下離心30min。用小勺刮去離心管上層的乳脂，用吸管將中間層的乳蛋白去掉，留下最底部的的沉淀層。向離心管底部加入600μL磷酸緩沖液（PBS），將底部沉淀捶打懸浮并轉(zhuǎn)移至1.5mL的離心管中，3500r/min常溫離心10min，棄去上層液體，保留底部沉淀。再向底部沉淀加乳化劑60μL、PBS?540μL，用振蕩器振蕩至沉淀完全懸浮，40℃恒溫水浴處理10min脫去體細(xì)胞周?chē)娜橹?500r/min，常溫離心10min，棄上清，加PBS?500μL懸浮沉淀，于12000r/min低溫離心10min使體細(xì)胞沉淀富集，棄上清。

步驟四，牛奶體細(xì)胞消化：向體細(xì)胞沉淀中加入350μL的DNA提取緩沖液，50μL的SDS，10μL的蛋白酶K，在56℃下水浴消化過(guò)夜。