[發明專利]一種石斛原球莖包埋玻璃化法超低溫保存方法有效
| 申請號： | 201210187472.3 | 申請日： | 2012-06-05 |
| 公開（公告）號： | CN102696579A | 公開（公告）日： | 2012-10-03 |
| 發明（設計）人： | 薛大偉;朱涵毅;王慧中 | 申請（專利權）人： | 杭州師范大學 |
| 主分類號： | A01N3/00 | 分類號： | A01N3/00 |
| 代理公司： | 杭州天正專利事務所有限公司 33201 | 代理人： | 黃美娟;王兵 |
| 地址： | 310036 浙江*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 石斛 球莖 包埋 玻璃化 超低溫 保存 方法 | ||
1.一種石斛原球莖包埋玻璃化法超低溫保存方法，其特征在于：所述方法為：
（1）預處理：取直徑為3~4mm的幼嫩石斛原球莖，置于預培養基中，4℃下黑暗培養7天，獲得預培養后的石斛原球莖；所述預培養基為添加4g/L瓊脂粉、0.4mol/L山梨醇或蔗糖的1/2MS培養液；
（2）兩步法包埋：將步驟（1）預培養后的石斛原球莖在褐藻酸鈉包埋液中室溫下浸泡20min，再移取石斛原球莖和褐藻酸鈉包埋液的混合液置于鈣離子包埋液中室溫下浸泡2~3h，獲得石斛原球莖的包埋顆粒；所述褐藻酸鈉包埋液為添加終濃度20g/L褐藻酸鈉、終濃度2mol/L甘油和質量終濃度4~5%高滲溶質a的MS基本培養液，所述高滲溶質a為蔗糖、二甲基亞砜或山梨醇；所述鈣離子包埋液為添加終濃度0.3mol/L氯化鈣和質量終濃度4~5%高滲溶質b的1/2MS培養液，所述高滲溶質b為蔗糖、二甲基亞砜或山梨醇；
（3）兩步法裝載：將步驟（2）石斛原球莖的包埋顆粒置于質量濃度60%的PVS2混合溶液中，0℃下處理30~60min，移去PVS2混合溶液，加入PVS2溶液，再在0℃下平衡2~3h，獲得裝載后的包埋顆粒；所述質量濃度60%的PVS2混合溶液為PVS2溶液與MS基本培養液以體積比3:2的混合溶液，所述PVS2溶液的質量終濃度組成為：0.4mol/L蔗糖、體積終濃度30%甘油、體積終濃度15%二甲基亞砜和體積終濃度15%乙二醇，溶劑為水；
（4）冷凍：將步驟（3）獲得裝載后的包埋顆粒保存在冷凍管中迅速置于液氮中；使用時，將液氮中保存的冷凍管取出，解凍后的包埋顆粒置于MS基本培養基中可恢復培養，實現所述石斛種子的超低溫保存。
2.如權利要求1所述的石斛種子包埋玻璃化法超低溫保存方法，其特征在于：步驟（1）所述幼嫩石斛原球莖為金釵石斛原球莖。
3.如權利要求1所述的石斛種子包埋玻璃化法超低溫保存方法，其特征在于：步驟（2）所述褐藻酸鈉包埋液為添加質量終濃度20g/L褐藻酸鈉、終濃度2mol/L甘油和質量終濃度4%山梨醇的MS基本培養液。
4.如權利要求1所述的石斛種子包埋玻璃化法超低溫保存方法，其特征在于：步驟（2）所述鈣離子包埋液為添加終濃度0.3mol/L氯化鈣和質量終濃度4%山梨醇的1/2MS培養液。
5.如權利要求1所述的石斛種子包埋玻璃化法超低溫保存方法，其特征在于：步驟（3）所述方法為：將步驟（2）石斛原球莖的包埋顆粒置于質量濃度60%的PVS2混合溶液中，0℃下處理60min，移去PVS2混合溶液，加入PVS2溶液，再在0℃下平衡2~3h，獲得裝載后的包埋顆粒。
6.如權利要求1所述的石斛種子包埋玻璃化法超低溫保存方法，其特征在于：所述1/2MS培養液終濃度組成為硝酸銨1650mg/L，硝酸鉀1900mg/L，二水氯化鈣440mg/L，MgSO4·7H2O?370mg/L，KH2PO4?170mg/L，KI?0.83mg/L，H3BO3?6.2mg/L，MnSO4·4H2O?22.3mg/L，ZnSO4·7H2O?8.6mg/L，NaMoO4·2H2O0.25mg/L，CuSO4·5H2O?0.025mg/L，CoCl2·6H2O?0.025mg/L，FeSO4·7H2O?27.8mg/L，NaEDTA·2H2O?37.3mg/L，肌醇100mg/L，煙酸0.5mg/L，煙酸吡哆醇0.5mg/L，煙酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸2mg/L，溶劑為水。
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