[發(fā)明專(zhuān)利]一種石斛原球莖包埋玻璃化法超低溫保存方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210187472.3
• 申請(qǐng)日: 2012-06-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102696579A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 薛大偉;朱涵毅;王慧中
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 杭州師范大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): A01N3/00
• 分類(lèi)號(hào): A01N3/00
• 代理公司: 杭州天正專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

（一）技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物組織超低溫保存方法，特別涉及一種石斛原球莖包埋玻璃化法超低溫保存方法。

（二）背景技術(shù)

石斛蘭屬是蘭科植物中的第二大家族，為多年生草本植物。原產(chǎn)地主要分布在亞熱帶和熱帶地區(qū)，共有1000多個(gè)種，其中我國(guó)有約76種。石斛蘭花姿有沒(méi)?；ㄉG麗，花期較長(zhǎng)，且大部分都有芳香性。是深受人們喜愛(ài)的觀(guān)賞花卉。同時(shí)石斛蘭有著極高的藥用價(jià)值。我國(guó)76個(gè)種的石斛蘭在那個(gè)有40種可做藥用。其中比較著名的有金釵石斛、鐵皮石斛和霍山石斛等。古籍上記載石斛具有強(qiáng)陰益精，補(bǔ)腎益力，輕身延年等作用，此外還有益胃生津，滋陰清熱，止咳潤(rùn)肺的功效?，F(xiàn)代研究也表明石斛中含有抗腫瘤，抗衰老和增加人體免疫力的成分。

但是石斛蘭本身繁殖能力極弱，石斛果實(shí)種子量大，無(wú)胚乳，在野生條件下必須與特定的蘭菌結(jié)合才能萌發(fā)。加上花卉市場(chǎng)和藥用市場(chǎng)對(duì)石斛蘭的需求日益增加，似的野生資源被過(guò)度采伐，使得石斛已被列為瀕危物種，采用石斛蘭組織培養(yǎng)技術(shù)成為石斛蘭大量繁殖的主要手段，但是長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)導(dǎo)致種質(zhì)資源流失，子代生長(zhǎng)力下降等問(wèn)題，形態(tài)發(fā)生能力和遺傳穩(wěn)定性下降。因此石斛蘭超低溫保存技術(shù)成為石斛種質(zhì)資源保存和保護(hù)瀕危物種的關(guān)鍵辦法。

（三）發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種石斛原球莖包埋玻璃化法超低溫保存方法，為石斛蘭的種子資源保存提供理論和技術(shù)支持。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種石斛原球莖包埋玻璃化法超低溫保存方法，所述方法為：

（1）預(yù)處理：取直徑為3~4mm的幼嫩石斛原球莖，置于預(yù)培養(yǎng)基中，4℃下黑暗培養(yǎng)7天，獲得預(yù)培養(yǎng)后的石斛原球莖；所述預(yù)培養(yǎng)基為添加終濃度4g/L瓊脂粉、終濃度0.4mol/L山梨醇或蔗糖的1/2MS培養(yǎng)液；

（2）兩步法包埋：將步驟（1）預(yù)培養(yǎng)后的石斛原球莖在褐藻酸鈉包埋液中室溫下浸泡20min，再移取石斛原球莖和褐藻酸鈉包埋液的混合液置于鈣離子包埋液中室溫下浸泡2~3h，獲得石斛原球莖的包埋顆粒；所述褐藻酸鈉包埋液為添加終濃度20g/L褐藻酸鈉、終濃度2mol/L甘油和質(zhì)量終濃度4~5%高滲溶質(zhì)a的MS基本培養(yǎng)液，所述高滲溶質(zhì)a為蔗糖、二甲基亞砜或山梨醇；所述鈣離子包埋液為添加終濃度0.3mol/L氯化鈣和質(zhì)量終濃度4~5%高滲溶質(zhì)b的1/2MS培養(yǎng)液，所述高滲溶質(zhì)b為蔗糖、二甲基亞砜或山梨醇；

（3）兩步法裝載：將步驟（2）石斛原球莖的包埋顆粒置于質(zhì)量濃度60%的PVS₂（玻璃化溶液）混合溶液中，0℃下處理30~60min（優(yōu)選60min），移去PVS₂混合溶液，加入PVS₂溶液，再在0℃下平衡2~3h（優(yōu)選2h），獲得裝載后的包埋顆粒；所述質(zhì)量濃度60%的PVS₂混合溶液為PVS₂溶液與MS基本培養(yǎng)液以體積比3:2的混合溶液，所述PVS₂溶液質(zhì)量終濃度組成為：0.4mol/L蔗糖、體積濃度30%甘油、體積濃度15%二甲基亞砜和體積濃度15%乙二醇，溶劑為水；

（4）冷凍：將步驟（3）獲得裝載后的包埋顆粒裝入冷凍管中，每管3~5個(gè)，將冷凍管迅速置于液氮中保存；使用時(shí)，將液氮中保存的冷凍管取出，解凍后的包埋顆粒置于MS基本培養(yǎng)基中可恢復(fù)培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)所述石斛種子的超低溫保存。

進(jìn)一步，步驟（1）所述幼嫩石斛原球莖優(yōu)選為金釵石斛原球莖，所述石斛幼嫩原球莖的獲得方法為：采用石斛組織（本發(fā)明優(yōu)選金釵石斛組織，取自《一種誘導(dǎo)石斛原球莖發(fā)生的方法》(申請(qǐng)?zhí)枺?01110445130.2)）方法誘導(dǎo)培養(yǎng)的，增殖30d左右的原球莖，取直徑3~4cm的幼幼嫩原球莖進(jìn)行包埋玻璃化法超低溫保存。

進(jìn)一步，步驟（2）所述褐藻酸鈉包埋液為添加質(zhì)量終濃度20g/L褐藻酸鈉、終濃度2mol/L甘油和質(zhì)量終濃度4%山梨醇的MS基本培養(yǎng)液。

進(jìn)一步，步驟（2）所述鈣離子包埋液為添加終濃度33.3g/L氯化鈣和質(zhì)量終濃度4%山梨醇的1/2MS培養(yǎng)液。

進(jìn)一步，步驟（3）所述方法優(yōu)選為：將步驟（2）石斛原球莖的包埋顆粒置于質(zhì)量濃度60%的PVS₂混合溶液中，0℃下處理60min，移去PVS₂混合溶液，加入PVS₂溶液，再在0℃下平衡2~3h（優(yōu)選2h），獲得裝載后的包埋顆粒。