[發明專利]一種檢測花生過敏成分Arah1的雙抗體夾心ELISA方法

無效

• 申請號: 201210187068.6
• 申請日: 2012-06-08
• 公開（公告）號: CN102680696A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 匡華;彭娟;胥傳來;王利兵;尹玉云;宋珊珊;朱建平;王文彬
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA檢測花生過敏成分Arah1方法的建立，屬于免疫分析技術領域。

背景技術

近年來，食物過敏已成為一個公眾性的食品安全問題，而花生是最常見的八大食品過敏原之一。過敏疾病嚴重危害人們的身體健康，雖然激發過敏反應的最低過敏原的量隨著人群的不同而不同，但是微量的過敏原就可以使絕大部分患者產生過敏癥狀。為了避免接觸微量的過敏原，過敏原的檢測成為當務之急。現在，雖然有許多過敏原檢測方法可供借鑒，但在具體應用上都存在著各自不同的問題。體內實驗方法可提供最為直接的證據，但由于安全因素等方面的考慮，只有在不得已的情況下在醫院進行，而且費用昂貴、風險大；與此相比體外實驗方法具有方便、安全點，但卻存在著準確性差的缺點。目前體外微量的檢測方法有免疫法、PCR法、組胺釋放實驗法、過敏原指紋快速檢測法等。雖然目前有關過敏原檢測的方法很多，但都存在各自不同的問題，如檢測速度慢、成本高、需要特定的分析儀器等，這些制約了食品中過敏原檢測方法的發展。因此實現準確、安全、經濟、快速、高通量、高靈敏的體外檢測技術方法具有現實意義。

雙抗體夾心法是檢測抗原的最常用方法，操作步驟如下：

1)將特異性抗體與固相載體聯接，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質；

2)加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗體抗原復合物。洗滌除去未結合的抗原物質；

3)加酶標抗體，保溫反應。固相抗體抗原復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時，固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關；

4)加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色，測知標本中抗原的量。

發明內容

本發明的目的在于建立一種可以直接、快速、高靈敏度、高特異性、高準確度、高精確度、操作方法簡單的雙抗體夾心ELISA方法。用于檢測花生過敏成分Arah1。

本發明所說的雙抗體夾心ELISA檢測花生過敏成分Arah1方法，是鼠抗花生過敏成分Arah1單克隆抗體作為一抗包被，與其配對成功的鼠抗花生過敏成分Arah1單克隆抗體用辣根過氧化物酶標記后作為二抗，夾心法檢測花生過敏成分Arah1。

本發明方法中所說的鼠抗花生過敏成分Arah1單克隆抗體，其制備方法是：雜交瘤的準備，篩選出針對花生過敏成分Arah1的強陽性細胞株14株用于免疫BALB/c小鼠，收集該免疫小鼠的腹水，進行脫脂純化酶標，將此14株細胞株進行配對篩選，得到配對成功即兩株能檢測針對花生過敏成分Arah1的細胞株。

本發明方法的檢測分析原理是：利用連接于固相載體上的抗體和酶標抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結合，形成固相抗體-抗原-酶標抗體免疫復合物。由于反應系統中固相抗體和酶標抗體的量相對于待測抗原是過量的，因此復合物的形成量與待測抗原的含量成正比（在本方法可檢測范圍內）。測定復合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質量（OD值），即可確定待測抗原含量。

本發明的技術方案：一種花生過敏成分Arah1的雙抗體夾心ELISA方法，?

（1）酶標板的制備：所用的包被原是鼠抗Arah1單克隆抗體，所用包被緩沖液是0.05?M、pH9.6碳酸鈉緩沖液，所用封閉液是含0.1％明膠的上述包被緩沖液；

其中，鼠抗Arah1單克隆抗體是花生蛋白粗提取液免疫BALB/c小鼠制備；

（2）酶標二抗是辣根過氧化物酶標記與一抗配對成功的鼠抗Arah1單克隆抗體；

（3）洗滌液PBST的配方為：1000?mL蒸餾水中加入氯化鈉8?g、磷酸二氫鉀0.2g、磷酸氫二鈉2.9?g、氯化鉀0.2?g、吐溫-20??0.5mL。

（4）標準品稀釋液的配方為：在含30%體積甲醇的pH?6.5的PBS中加入質量比為5%的氯化鈉；

（5）顯色液包括A液和B液，A液配方為每100?mL水中加入0.933?g檸檬酸，3.68?g?Na₂HPO₄·12H₂O，18?μL?30%H₂O₂；B液配方為60?mg四甲基聯苯胺溶于100?mL乙二醇，使用時按A︰B=1︰1體積比使用；

（6）終止液為2?mol/L的硫酸；

檢測步驟為：?