[發明專利]一種基于指紋圖譜的可可粉摻假檢測方法

有效

• 申請號: 201210186695.8
• 申請日: 2012-06-07
• 公開（公告）號: CN102680607A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 戴軍;王琴;胡明華;陳尚衛;朱松
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明涉及一種基于指紋圖譜的可可粉摻假檢測方法，特別是一種通過構建多糖指紋圖譜以判定可可粉是否摻假的方法。

背景技術

可可粉具有濃烈芬芳的獨特香味,含有豐富的多酚、蛋白質、碳水化合物、可可脂等多種營養元素和活性成分，是制造巧克力的重要原料，也用于生產當今世界三大嗜好性飲料之一。上個世紀90年代中期以來，隨著可可制品應用范圍的日趨擴大，對外貿易的拓展,我國可可加工行業發展迅猛，與此同時，國內市場上大量劣質或假冒可可粉充斥市場，不僅嚴重危害了食品安全，也影響了我國的國際貿易信譽和正規可可加工廠家的利益。金永生等對可可粉中摻入大豆粕、芝麻粕、花生殼和板栗殼等幾種外源植物源性成分的PCR檢測方法進行了探索研究，建立的方法準確性易受雜質影響，不能鑒別可可殼粉這種主要的內源性摻假物；另外，可能添加的外源植物源性成分種類繁多，難以預料，實際操作中不可能對所有可能添加的外源植物源性成分逐個進行PCR檢測，因此該方法有很大局限性，難以推廣。為此，本發明首次針對目前常見的使用可可殼粉摻混可可粉的現象，嘗試采用超聲輔助提取可可粉中多糖組分,利用硫酸水解及柱前PMP(1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮)衍生化高效液相色譜法(HPLC)分析得到可可粉多糖組分的指紋圖譜，再根據共有特征峰的相對峰面積，應用系統聚類分析方法成功地對摻入可可殼的可可粉進行了分析鑒別。

本發明可為我國可可粉的質量檢測方法和質量標準的提升及完善提供科學依據與參考，從而促進我國可可粉產品的質量提高和穩定，更好地規范可可粉市場，維護消費者權益。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種準確可靠且較簡便，可推廣應用于可可粉的摻假檢測方法。本發明還同時提供了可可粉多糖的標準指紋圖譜。

本發明的技術方案：

首先，構建可可粉多糖標準指紋圖譜，包括可可粉多糖的提取、可可粉多糖的水解、可可粉多糖水解產物的PMP(1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮)衍生化反應、高效液相色譜的指紋分析及其標準指紋圖譜的確定；

然后，根據可可粉標準樣品多糖單糖組成的測定方法，測定模擬摻假樣品的多糖單糖組成；

最后，根據可可粉標準樣品和模擬摻假樣品多糖單糖組成的相對峰面積組成的矩陣，進行聚類分析。

本發明的具體步驟為：

1、可可粉多糖指紋圖譜的建立方法包括下列步驟：

⑴可可粉多糖的提取：稱取經過索氏提取去脂的殘渣700mg，置于50ml離心管中，加入25ml?80%乙醇超聲提取兩次，每次15min。離心（5000rmp，5min）后沉淀用無水乙醇20ml洗滌，離心，去上清液，沉淀放入培養皿中于烘箱50℃條件下干燥。稱取400mg的干燥粉末，加入pH?8.0的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液40ml，堿性蛋白酶Alcalase加酶量為5500（U/g），50℃酶解4h。100℃滅酶10min后加入3倍體積的無水乙醇，4℃過夜。離心（5000rpm，5min）棄上清，沉淀中再加80%乙醇，超聲5min，用手振搖2min，靜置，離心。沉淀用無水乙醇洗滌20ml，干燥，即得粗多糖。

⑵可可粉多糖的水解：稱取粗多糖100mg，加入72%H₂SO41ml,30℃水解1h，然后稀釋至2M，100℃，水解2h，水解液中加一定體積的水，用BaCO₃中和（中和至加入BaCO3后不再產生氣泡，且pH為7.0），離心，上清液過濾并用水定容至5ml，備用于下述PMP衍生化。

⑶可可粉多糖水解產物的衍生化：取100μL的可可粉多糖水解產物與100μL的0.6mol/LNaOH溶液，置于1mL的離心管中混合均勻；再取50μL的混合液于5mL的具塞試管中，加50μL0.5mol/L的PMP(0.4355g/5mL)甲醇溶液，漩渦混勻；在70℃水浴鍋中反應40min，取出放置10min冷卻至室溫，加60μL?0.3mol/L的HCl中和，加水至1mL，再加等體積的氯仿，振搖，靜置，棄去氯仿相，如此萃取3次。將水相用0.45μm微孔膜過濾后供HPLC進樣分析。