[發(fā)明專利]一種基于指紋圖譜的可可粉摻假檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210186695.8
• 申請日: 2012-06-07
• 公開（公告）號: CN102680607A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設計）人: 戴軍;王琴;胡明華;陳尚衛(wèi);朱松
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京匯信合知識產(chǎn)權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

1.一種基于指紋圖譜的可可粉摻假檢測方法，其特征在于，包括步驟：

1）構建可可粉標準品多糖標準指紋圖譜，首先提取可可粉標準品多糖、對可可粉標準品多糖進行水解，隨后進行可可粉標準品多糖水解產(chǎn)物的PMP衍生化反應、高效液相色譜的指紋分析，最終按照獲得的結果繪制可可粉標準品多糖標準指紋圖譜；

2）采用步驟1）的中可可粉標準樣品多糖單糖組成的測定方法，測定實際送樣可可粉的多糖單糖組成；

3）將步驟2）獲得的結果與步驟1）中的標準指紋圖譜進行相對峰面積組成的矩陣，進行聚類分析。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述構建可可粉標準品多糖標準指紋圖譜的具體步驟為：

1）可可粉多糖的提取:

稱取經(jīng)過索氏提取去脂的殘渣700mg，置于50ml離心管中，加入25ml?80%乙醇超聲提取兩次，每次15min；5000rmp，離心5min后沉淀用無水乙醇20ml洗滌，離心，去上清液，沉淀放入培養(yǎng)皿中于烘箱50℃條件下干燥；稱取400mg的干燥粉末，加入pH?8.0的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液40ml，堿性蛋白酶Alcalase加酶量為5500U/g，50℃酶解4h；100℃滅酶10min后加入3倍體積的無水乙醇，4℃過夜；5000rmp，離心5min后棄上清，沉淀中再加80%乙醇，超聲5min，用手振搖2min，靜置，離心；沉淀用無水乙醇洗滌20ml，干燥，即得粗多糖；

2）可可粉多糖的水解:

稱取粗多糖100mg，加入72%H₂SO₄1ml,30℃水解1h，然后稀釋至2M，100℃，水解2h，水解液中加一定體積的水，用BaCO₃中和至不再產(chǎn)生氣泡、pH為7.0為止，離心，上清液過濾并用水定容至5ml，備用于下述PMP衍生化；

3）可可粉多糖水解產(chǎn)物的PMP衍生化反應:

取100μL的可可粉多糖水解液與100μL的0.6mol/LNaOH溶液，置于1mL的離心管中混合均勻；再取50μL的混合液于5mL的具塞試管中，加50μL0.5mol/L的PMP甲醇溶液，漩渦混勻；在70℃水浴鍋中反應40min，取出放置10min冷卻至室溫，加60μL?0.3mol/L的HCl中和，加水至1mL，再加等體積的氯仿，振搖，靜置，棄去氯仿相，如此萃取3次；將水相用0.45μm微孔膜過濾后供HPLC進樣分析；

4）高效液相色譜的指紋分析:

色譜柱：ZORBAX?Eclipse?XDB-C18，250mm×4.6mmi.d.，5μm；流動相：PH?6.7的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液/乙腈，體積比為83:17；柱溫：30℃；檢測波長：250nm；流速：1.0ml/min；進樣體積:20μL。在此條件下進樣分析步驟(3)過濾后的PMP衍生化產(chǎn)物，得到可可粉多糖的高效液相色譜指紋圖譜；

5）標準指紋圖譜的確定:

通過11個不同產(chǎn)地的可可粉樣品中的多糖水解產(chǎn)物的PMP衍生物的高效液相色譜測定，比較其色譜圖，確定共有12個特征峰；所述共有特征峰以葡萄糖峰為參照的相對保留時間RT的相對標準偏差RSD均小于1%。

3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所述特征峰分別為甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖糖、巖藻糖。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2）中聚類分析選擇組間距離作為聚類方法、歐氏距離平方法作為測量距離，以12個共有特征峰的相對峰面積組成的矩陣進行聚類分析，其中8號峰作為參照峰。